Transkrypcja genów jądrowych u roślin i jej regulacja

Maszyneria transkrypcyjna - prokarionty Mechanizmy regulacji ekspresji genów różnią się zasadniczo u eukariontów i prokariontów. U prokariontów stan podstawowy dla transkrypcji jest nierestrykcyjny (brak ograniczenia dostępności do DNA dla kompleksu RNA polimerazy). Negatywna regulacja jest rzadka i zależy od represorów specyficznych dla konkretnych sekwencji. U prokariontów sieć regulatorowa genów ma niską złożoność. Pojedynczy TF reguluje średnio 3 geny, a pojedynczy gen jest pod kontrolą średnio dwóch TF. Wiele promotorów regulowanych jest przez pojedynczy regulator. Regulatory te rzadko regulują transkrypcję innych TF. U prokariontów, wiążące się z DNA, specyficzne sekwencyjnie TF na ogół rozpoznają długie sekwencje (>12 par zasad).

Maszyneria transkrypcyjna - eukarionty U eukariontów stan podstawowy dla transkrypcji jest restrykcyjny, co wynika z upakowania DNA w chromatynę, która uniemożliwia rozpoznawania standardowych promotorów przez podstawową maszynerie transkrypcyjną. Wpływ struktury chromatynowej promotora na jego dostępność czyni niezbędnym udział w regulacji transkrypcji czynników modyfikujących chromatynę. Określa to w zasadniczy sposób model regulacji transkrypcji u eukariontów. W systemie regulacji uczestniczą nie tylko składniki podstawowej maszynerii transkrypcyjnej i wielka liczba TF wiążących się ze specyficznymi sekwencjami DNA, ale także bardzo liczne i rozmaite białka związane z chromatyną. U eukariontów regulatory transkrypcji działają według logiki kombinatorycznej, co skutecznie zwiększa liczbę i różnorodność aktywności regulatorowych i prowadzi do dużej złożoności sieci regulacyjnych. Sekwencje rozpoznawane przez eukariotyczne TF mają długość 5-10 par zasad.

Polimerazy RNA u eu- i prokariontów Pro: podjednostki 2Xalfa, β, β’, ω (omega) (Holoenzym ca. 500 000 D) Eu: 12 podjednostek (Holoenzym ca. 550 000 D)

Promotor prokariotyczny Obejmuje dwie podstawowe sekwencje zaangażowane w kontrolę transkrypcji: TATAAT (-10 pz) i TTGACA (-35 pz)

Inicjacja transkrypcji u prokariontów Polimeraza RNA wiąże się do DNA i przesuwa się po nim aż do odnalezienia promotora Podjednostka sigma rozpoznaje sekwencję -35 pz i powoduje ścisłe związanie polimerazy. Na obszarze -10 pz następuje rozplatanie podwójnej helisy DNA

Inicjacja i elongacja transkrypcji u prokariontów Podjednostka sigma odłącza się od czterech pozostałych podjednostek polimerazy. Polimeraza kontynuuje transkrypcję

System regulacji operonowej u bakterii

Represor lambda (helix-turn-helix)

Elementy regulatorowe genów eukariotycznych

Białka związane z transkrypcją u eukariontów należą do 4 zróżnicowanych funkcjonalnie grup 1. Podstawowy aparat transkrypcyjny i związane z nim ogólne czynniki transkrypcyjne (GTF - General Transcription Factors) 2. Specyficzne w stosunku do sekwencji, wiążące się z DNA czynniki transkrypcyjne (TF). 3. Duże wielo-podjednostkowe kompleksy koaktywatorów i innych kofaktorów. 4.Białka związane z chromatyną

Podstawowy aparat transkrypcyjny i związane z nim ogólne czynniki transkrypcyjne (GTF - General Transcription Factors) Pol II - podjednostkowy holoenzym, wymaga dodatkowych czynników (TFII: A, B, D, E, F, H) dla rozpoznania promotora i inicjacji. TFIIB – umiejscawia Pol II na promotorze TFIIH – rozplata DNA TFIID – podjednostkowy kompleks odpowiedzialny za ogólne rozpoznanie promotora (zawiera TBP i TAFs (TBP-Assiociated Factors – odpowiedzialne za specyficzność i różnorodność odpowiedzi transkrypcyjnych)

Funkcja TBP-Associated Factors (TAFs)

Duże wielo-podjednostkowe kompleksy koaktywatorów i innych kofaktorów. Białka z AT-hook, zdolne do zginania DNA

Specyficzne w stosunku do sekwencji, wiążące się z DNA czynniki transkrypcyjne (TF).

Specyficzne w stosunku do sekwencji, wiążące się z DNA czynniki transkrypcyjne (TF) - 2

Czynnik transkrypcyjny AP-1 (Leu-Zip)

Czynnik transkrypcyjny Sp1

Funkcja enhancerów

Izolatory rozgraniczają domeny kontrolowane przez różne promotory

Meyerowitz 2002

Rodziny czynników transkrypcyjnych w Arabidopsis

Rodziny Homeobox (HB) i Zinc-Finger-Homeobox (ZF-HB) w Arabidopsis Rodzina Homeobox w Arabidopsis zawiera klasy z różnymi kombinacjami domen białkowych, różnice wynikają też z fiologenezy domeny HB. Specyficzny układ domen (leucine zipper, PHD finger, STAR) wynika z ich mieszania charakterystycznego dla roślin, nie występuje w innych królestwach (Drosophila, C. elegans, drożdże). Białka ZF-HB mają specyficzny tylko dla roślin motyw koordynujący cynk.

Porównanie rodzin czynników transkrypcyjnych u eukariontów

Zawartość i rozkład rodzin czynników transkrypcyjnych u eukariontów

Rodzina czynników transkrypcyjnych: AP2/EREBP i profile ekspresyjne z mikromacierzy dla różnych części i organów. Wzrost transkrypcji: czerwone – ponad 8-krotny, różowe - 2- do 8-krotny; żółte - ±2-krotny; Spadek transkrypcji: zielone ponad 2-krotny. Brak transkrypcji – szare.

Chromatyna w regulacji transkrypcji

Chromatin regulators act as common modifiers of diverse signaling pathways Systematic mapping of genetic interactions in C. elegans identified six ‘hub’ genes that enhance the phenotypic consequences of mutations in many different pathways. All six hub genes encode components of chromatin modifying complexes. Chromatin modifiers may function as genetic buffers (similar to hsp90) preventing cumulation of effects of mutations in multiple functionally unrelated genes and in many otherwise unlinked pathways. Interaction network for EGF signaling. Lehner et al. Nature Genet. (2006)

Lokalizacja ogonów histonowych w nukleosomie H2A H2A H2B H2B

Acetylacja lizyny

Modyfikacje histonów ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPH DFKTD SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLAR KRKTV Lysine acetylation Serine Phosphorylarion Arginine Methylation Lysine Methylation

Modyfikacje histonów SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRV PKKTE H2A SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRV PKKTE H2B PEPSKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDGKKRK VTKYT Lysine acetylation Serine Phosphorylarion Arginine Methylation Lysine Methylation Lysine Ubiquitination

Kod histonowy

Wzór metylacji H3K9 w Arabidopsis DAPI aH3K9 After Jackson et al., Chromosoma 112: 308-315

Analiza odpowiedzi tytoniowych komórek BY-2 na 250mM NaCl 0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min. 0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min. anty-fosfo(S10)-H3 0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min. anty-fosfo(S10)-acetyl(K14)-H3 0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min. 0 5 10 15 20 30 45 60 90 min. 0 5 10 15 20 30 45 60 90 min. anty-acetyl-H4 min. 0 15 30 45 60 90 120 3% aktyna Tsi1 NtC7 osmotyna intensywność sygnału western-blot, wyrażonaw jednostkach umownych, przypadająca na ilość białka

Analiza odpowiedzi linii Arabidopsis thaliana T87 na 250mM NaCl 0 15 30 60 90 min. 0 15 30 60 90 min. anty-fosfo(S10)-H3 0 15 30 60 90 min. 0 15 30 60 90 min. anty-fosfo(S10)-acetyl(K14)-H3 DREB1A DREB2A RD29A COR15A aktyna kontrola pozytywna 0 15 30 60 90 intensywność sygnału western-blot, wyrażonaw jednostkach umownych, przypadająca na ilość białka

Metylacja cytozyn w DNA Reaction: Cytosine → 5-methylcytosine (5mC) Enzymes: Diverse group of DNA methyltransferases (Dnmt’s) Sequence context: CpG – animals CpG (major), CpNpG, CpNpNp - plants

ATP dependent Chromatin Remodeling Kingston, R.E., Narlikar, G.J. Genes&Development 13:2339-2352(1999)

ATPases of DEXD/H family are motor subunits of chromatin remodeling complexes HelicC DEXD/H HelicC SNF2_N

Major types of ATP-dependent chromatin remodeling complexes SWI/SNF ISWI Mi2 Mi2 Swp73 Swi3 Snf5 Snf2 ISWI ATPase Bromodomain ATPase SANT/SLIDE ATPase Chromodomain

Visualization of the remodeling activity: ‘sliding assay’ with nucleosomes reconstituted on 248bp rDNA End position Center position

Sliding of nucleosomes induced by Arabidopsis ATPase DDM1 (Decrease in DNA Methylation 1) Brzeski&Jerzmanowski J.Biol.Chem. 2003

Modyfikacje histonów w aktywacji i wyciszaniu tranaskrypcji

Interferencja RNA (RNAi) w ustanawianiu stanu nieaktywnej chromatyny

Chromatynowy system aktywacji i hamowania transkrypcji From: Stevenson & Jarvis

Hipotetyczny kompleks SWI/SNF w Arabidopsis AtSWP73 AtSWI3 BSH (SNF5) AtSNF2

Major remodeling ATPases

Two distinct and highly conserved subclasses of SWI/SNF complexes occur in yeast and animals Subfamily SWI/SNF/BAP/BAF Subfamily RSC/pBAP/pBAF (non-essential) (essential) ______________________________________________________________________________________________________________________ SWI/SNF BAP BAF RSC pBAP pBAF yeast Drosophila human yeast Drosophila human Swi2/Snf2 Brahma BRG1 or hBRM Sth1/Nsp1 Brahma BRG1 Swi3 BAP155/Moira BAF170 and BAF155 Rsc8 BAP155/Moira BAF170&BAF155 Snf5 Snr1 hSNF5/INI1 Sfh1 Snr1 hSNF5/INI1 Swp73/Snf12 BAP60 BAF60a Rsc6 BAP60 BAF60a or BAF60b Swp61/Arp7 BAP55 BAF53 Rsc11/Arp7 BAP55 BAF53 Swp59/Arp9 Rsc12/Arp9 Actin Actin Actin Actin Swi1 OSA (ARID-domain protein) BAF250 Rsc1,Rsc2,Rsc4 Polybromo BAF180 Swp82 Snf6 Swp29/TafII30 Snf11 Rsc5,7,10,13-15 Rsc3, Rsc30

Is a functional pattern of SWI/SNF specialization maintained in plants? SWI/SNF family Non-essential Essential Signature subunit: OSA Yeast SWI/SNF Drosophila BAP Human BAF Plants? Signature subunit: Polybromo Yeast RSC Drosophila pBAP Human pBAF Plants?

Arabidopsis SWI/SNF complexes – the landscape of possibilities

Hypothetical organization of SWI/SNF remodeling in Arabidopsis

Hipotetyczny kompleks SWI/SNF w Arabidopsis AtSWP73 AtSWI3 BSH (SNF5) AtSNF2

Homologi SWI3 w A. thaliana AtSWI3A (At2g47620) AtSWI3B (At2g33610) AtSWI3C (At1g21700) AtSWI3D (At4g34430) ySWI3

Drzewo filogenetyczne białek typu SWI3

ATAF2 ATSWI3B E3 AAA FCA BIP7 (11-17) ATGP4 RPT3 BIP6 (11-16) (1-57) HD2A PIRIN SAHH CobW PRL2 AMIDASE ATSWI3C AtBRM Farrona et. al., 2004 ATSWI3D ATSWP73A HD2B PRL1 BSH AKIN 10/11 ATAF2 ATSWI3A ATSWI3B E3 AAA FCA BIP7 (11-17) RPT3 ATGP4 Proteins studied in Csaba Koncz’ laboratory BIP6 (11-16) JMJC Interactions identified In Csaba Koncz’ laboratory BIP1 (1-57) Core subunits of the SWI/SNF chromatin remodeling complex except for ATPase plus the FCA protein BIP2 (3-32) ARM Interactions verified in pGBT9/pGAD424 system SRC2 RPL12 BIP3 (3-45) Interactions verified in pGBT9/pACT2 system ATPase COP9 ANAC102 BIP5 (1-30) Weak interactions identified in pGBT9/pACT2 system PUX2 BIP4 (3-46) Di19 esterase family protein Proteins identified through the yeast two hybrd screen Interactions identified by other researchers from our laboratory in the pGBT9/pGAD424 system