Zastosowanie kalorymetrii ITC w badaniach białek Katarzyna Breer

Kalorymetria, czyli ,,mierzenie ciepła’’ DSC (differential scanning calorimetry) ITC (isothermal titration calorimetry) www.microcal.com

Current Opinion in Structural Biology T – const, p – const 81 mM domena SH2 Lck ligand 0.4mM fosfopeptyd TEGOqYQPQPA Current Opinion in Structural Biology Leavitt and Freire 2001

Warianty metody Enzym/substrat/inhibitor Single injection Dysocjacja (dimeru)

Kalorymetr ITC VP-ITC Objętość celki ~1.4 ml Objętość strzykawki ~ 270ml Peltier 2-800C Szum 0.5 ncal/s

Jakie informacje można uzyskać z krzywej miareczkowania ITC? Miareczkowanie ~8 mM PNP (cielęce) Guaniną 20 mM Hepes pH 7.0, 250C DQL=DHL DHcal DQML=DHML

Identyczne, nieoddziałujące miejsca wiązania  – frakcja miejsc zajętych 1-  – frakcja miejsc wolnych [L]t = [L] + n[M]t Q = n[M]t ·V0DHML

Parametr sigmoidalności C = Ka [M]t 10 < C < 1000 Ka ~108 – 109 M-1 Wiseman et al. 1989

Proteaza HIV-1 KA ~KB Leavitt and Freire 2001

Wiązanie kompetycyjne Słaby inhibitor Silny inhibitor DQ(i) = V0 [M]t (DHADA(i) + DHBDB(i)) Sigurskjold 2000

Parametry termodynamiczne U(S,V,N) = TS – pV + SmN dU (S,V,N) = TdS – pdV + SmidNi Naturalne zmienne ITC to (T,p,N) G (T,p,N) = U – TS + pV = SmiNi Energia chemiczna dG (T,p,N) = –SdT + Vdp + SmidNi dG  0 Proces spontaniczny

Związek entalpii, entropii i energii swobodnej Gibbsa G = U + pV – TS = H – TS dG = dH – TdS Wkład entropowy Solwatacja Wewnętrzne stopnie swobody Wkład entalpowy (cieplny) Wiązania wodorowe Oddziaływania van der Waalsa Oddziaływania elektrostatyczne

DG = -RTln Ka ~8 mM PNP ~0.2 mM PNP 250C, 20 mM Hepes pH 7.0 DHcal = -14.2  0.1 kcal/mol TDS = -5.0 kcal/mol ~8 mM PNP DG = -RTln Ka 250C, 20 mM Hepes pH 7.0 N = 0.5  0.1 Ka = (11.3  0.9) 106 M-1 ~0.2 mM PNP

[M]t = 0.92 mM [M]akt = 0.96 mM Ka = (5.3  2.5) 109 M-1

Zachowania nieszablonowe Miejsca oddziałujące – kooperacja Niezależnie wiążące miejsca [L]t = [L] + [M]t(n11DH1+n22DH2) Q = [M]tV0(n11DH1 + n22DH2)

Miareczkowania PNP ligandem DFPP-DG K1 = (6.7  6.4 ) 1010 M-1 DH1 = -6.3  0.05 kcal/mol TDS1 = 8.2 kcal/mol N2 = 0.2 K2 = (3.1  2.8) 108 M-1 DH2 = 5.8  0.2 kcal/mol TDS2 = 17.6 kcal/mol N = 1.0 Ka = (1.2  0.5) 109 M-1 DH = -5.7  0.04 kcal/mol TDS = 6.6 kcal/mol 20 mM Hepes pH 7.0, 200C

Analiza van’t Hoff’a Ka Entalpia van’t Hoff’a Izobara van’t Hoff’a

Ka Entalpia van’t Hoff’a

Forma całkowa izobary van’t Hoff’a Polimeraza Klenowa Forma całkowa izobary van’t Hoff’a Datta et al., 2006

Napędzana entalpowo TS Napędzana entropowo TH Napędzana entalpowo TS DCp ~ - (0.9 – 1.2) kcal/(mol K)

Zależność DHcal(T) dla wiązania DFPP-DG przez PNP DCp – const. DCp = -0.202  0.031 kcal/(mol K)

Zależność Kas (T) Kas ~109-1011 M-1 Poza zakresem pracy metody

 ligand Guanina N = 0.9 Ka = (1.4  0.1) 107 M-1 DH = -12.0  0.1 kcal/mol TDS = -2.4 kcal/mol N1 = 1.0 K1 = (0.2  1.7) 1011 M-1 DH1 = -6.2  0.1 kcal/mol TDS1 = 7.6 kcal/mol N2 = 0.1 K2 = (0.4  3.0) 109 M-1 DH2 = 9.6  2.6 kcal/mol TDS2 = 1.7 kcal/mol  ligand Guanina

Zmiany entropii i entalpii DH (T) = DHconf (T) + DHintrinsic (T) DS (T)= DSsolv (T) + DSconf (T) + DSinne(T) DSsolv (T) = DCpln(T/TS)

ASA solvent accessible surface area DH = DHconf + a(T)·DASAap + b(T) ·DASApol DCp ap < 0 DCp pol > 0 Luić et al. 2004

Kompleksy białko – białko Fab E8 cytochrom c oraz przeciwciało E8 DCp ~ - (0.2 – 0.6) kcal/(mol K) Mylvaganam et al., 1998

DHcal – DHvH = const

Przepływ protonów DHapp = DHbind + nH+DHion Acetate 0.1 kcal/mol Todd et al., 2000 DHapp = DHbind + nH+DHion Miareczkowania proteazy HIV-1 indivinavirem Acetate 0.1 kcal/mol MES 3.7 kcal/mol ACES 7.5 kcal/mol

Równowaga dynamiczna Kconf K1 K0 log Kconf DCp app jedna forma wiąże obie formy wiążą ligand Eftink et al., 1983

Kompleksy białko – DNA Temperature Dragan et al., 2004

Jak projektować inhibitory? 4·109 M-1 5·1010 M-1 9·1010 M-1 1011 M-1

130x 15x 25x 40x Mutant V82F/I84V Muzammil et al., 2007

MDR mutant 700x 50x 20x 20x

Allosteria ,,entropowa” Białko CAP

BRAK ZMIAN KONFORMACYJNYCH Na podstawie widm NMR 2D 1H-15N HSQC BRAK ZMIAN KONFORMACYJNYCH

ms – ms powolne ruchy domen

Podziękowania dla: Romana Szczepanowskiego Matthias’a Bochtler’a

DS > 0 woda została wypchnięta z powierzchni kompleksu Energie wiązań: Elektrostatyczne w wodzie ~1A 20kJ/mol Wodorowe 4-25 kJ/mol Hydrofobowe 4 kJ/mol van der Waalsa 0. 5 kJ/mol DS > 0 woda została wypchnięta z powierzchni kompleksu DS < 0 może mieć wiele przyczyn i nie koniecznie znaczyć, że hydratacja wzrosła, bądź się nie zmieniła