wpływ promieniowania na przebieg szlaku NFkB POWIĄZANIA SZLAKÓW SYGNAŁOWYCH ZALEŻNYCH OD CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH NFkB I p53 W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH PODDANYCH DZIAŁANIU CZYNNIKÓW GENOTOKSYCZNYCH – wpływ promieniowania na przebieg szlaku NFkB Katarzyna Szołtysek Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów

Mechanizm regulacji NFkB, współzależności z p53

Cel pracy Identyfikacja funkcjonalnych współzależności między szlakami sygnałowymi zależnymi od czynników transkrypcyjnych NFkB i p53, poprzez m.in. scharakteryzowanie wpływu każdego z tych białek na ekspresję genów regulowanych przez drugi czynnik Cel szczegółowy: wpływ promieniowania na przebieg ścieżki NFkB Analiza kinetyki aktywacji i przebiegu ścieżki sygnałowej zależnej od NFkB w komórkach stymulowanych promieniowaniem i /lub cytokiną TNFa (analiza Western- blot i EMSA) Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na ekspresję wybranych genów regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NFkB (analiza QRT- PCR) Analiza wpływu czasu napromieniowania na ekspresję wybranych genów regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NFkB (analiza QRT-PCR)

Model doświadczalny HCT116 (human colon carcinoma) p53+/+ (wt) p53-/- (knock-out) RYC.1. Komórki linii HCT116 (wt). Charakterystyka modelu doświadczalnego: RYC.2. Transkrypcja genu TP53 (RT-PCR) w komórkach linii HCT116 pod wpływem napromienienia UV-C. RYC.3. Akumulacja białka p53 (Western-blot) w komórkach linii HCT116 pod wpływem napromienienia UV-C lub IR. Indukcja/akumulacja białka p53 UV = 20J/m2 IR = 4 Gy TNFa = 10ng/ml RYC.4. Kinetyka degradacji białka IkBa (Western-blot) w komórkach linii HCT116 stymulowanych cytokiną TNFa (15-min). Indukcja ścieżki NFkB - degradacja inhibitora IkBa

Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na aktywację szlaku NFkB i ekspresję wybranych genów zależnych od NFkB K lub Układ doświadczalny: TNFa = 10ng/ml UV = 20J/m2 IR = 4Gy Wykonane analizy: identyfikacja genów indukowanych przez TNFa (profil ekspresji – macierz QRT-PCR) ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów (QRT-PCR) analiza kinetyki degradacji inhibitora IkBa (Western-blot) analiza obecności aktywnego NFkB w jądrze komórkowym (EMSA) Wybrane geny: Podjednostki czynnika NFkB: geny NFKB1 i REL Białka regulujące ścieżkę NFkB: geny NFKBIA, BCL3, TNFAIP3 Geny odpowiedzi komórkowej prozapalnej (TNFA, IL1A, IL8, LTA ) i proprzeżyciowej (JUN)

efekt niezależny od statusu białka p53 Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie hamuje aktywację NFkB i obniża poziom ekspresji genów zależnych od NFkB w komórkach stymulowanych przez TNFa; efekt niezależny od statusu białka p53 RYC.1. Kinetyka zmian poziomu białka IkBa (Western-blot) w komórkach poddanych kombinacji stymulacji cytokiną TNF a i promieniowania UV. Przykładowa analiza przeprowadzona 1h i 6h po stymulacji cytokiną TNFa RYC.2. Detekcja aktywnych form NFkB (test EMSA) w ekstraktach jądrowych z komórek napromieniowanych UV i stymulowanych cytokiną TNFa (wynik testu przeprowadzonego przez dr Natalię Kashchak).

Analiza wpływu czasu napromieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na ekspresję wybranych genów zależnych od NFkB Układ doświadczalny: TNFa = 10ng/ml UV = 20J/m2 Wykonane analizy: ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów zależnych od NFkB (QRT-PCR)

efekt niezależny od statusu białka p53 Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresji genów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji; efekt niezależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8 (QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

efekt niezależny od statusu białka p53 Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresji genów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji; efekt niezależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3 (QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

efekt zależny od statusu białka p53 Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresji genów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa; efekt zależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8 (QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

efekt zależny od statusu białka p53 Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresji genów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa; efekt zależny od statusu białka p53 p<0,01 (dla wersji eksperymentalnych UV/TNF) RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3 (QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

Podsumowanie Komórkowa odpowiedź na promieniowanie jest modulowana przez sekwencję czasową aktywacji ścieżek sygnałowych zależnych od czynników NFkB i p53 Napromienienie komórek poprzedzające stymulację cytokiną TNFa hamowanie aktywacji ścieżki NFkB i osłabienie ekspresji genów zależnych od NFkB – niezależnie od p53 oscylacje poziomu genów zależnych od NFkB – zależnie od p53