WYKŁAD 3-4 16.03.18

Techniki chromatograficzne

Chromatografia Chromatografia to metoda rozdziału mieszanin związków oparta na różnicy współczynników podziału składników mieszaniny pomiędzy dwie fazy: Fazę stacjonarną (nieruchomą) Fazę ruchomą

Chromatograficzne metody rozdziału mieszanin związków Chromatografia kolumnowa (fleszowa) (FC – Flash Chromatography) Chromatografia cienkowarstwowa (TLC - Thin Layer Chromatography)

Chromatografia kolumnowa (fleszowa) Fazy stacjonarne: SiO2, Al2O3, celuloza, jonity Fazy ruchome: Rozpuszczalniki organiczne, roztwory buforowe, woda Zbiornik fazy ruchomej Szklana kolumna wypełniona granulowaną fazą stacjonarną Spiek szklany Probówki do zbierania eluatu

Chromatografia cienkowarstwowa Faza stacjonarna umieszczona na płytce Faza ruchoma (ciecz) wędruje w górę płytki

Chromatografia cienkowarstwowa (wywoływanie chromatogramu)

Chromatografia cienkowarstwowa droga przebyta przez rozpuszczalnik RF = droga przebyta przez substancję droga przebyta przez rozpuszczalnik RF to współczynnik podziału substancji pomiędzy fazę stacjonarną i ruchomą próbka wzorzec

Chromatograficzne metody analizy mieszanin związków Chromatografia gazowa (GC, GLC) Chromatografia cieczowa (HPLC) GC lub HPLC sprzężona ze spektrometrią mas (GC-MS, LC-MS)

Chromatograf gazowy gazy dozownik kolumna piec detektor Filters/Traps Data system H RESET Regulators Syringe/Sampler Air Hydrogen Gas Carrier Inlets Detectors gazy dozownik kolumna piec detektor akwizycja danych Column

Chromatografy gazowe

Kolumny do chromatografii gazowej Kolumna kapilarna Kolumna metalowa

Rodzaje kolumn do chromatografii gazowej

Jak działa chromatograf gazowy?

Chromatografia gazowa gazowy Sample: mixture of volatile liquids (~1L) Gas Chromatogram B E C A Abundance D 5 10 15 20 Time (minutes)

Czas retencji

Identyfikacja nieznanego związku – analiza jakościowa

Analiza ilościowa mieszaniny

Chromatogram mieszaniny estrów metylowych kwasów tłuszczowych

Rozdzielczość pików w GC

Czynniki poprawiające rozdzielczość pików: Wzrost długości kolumny Zmniejszenie średnicy kolumny Zmniejszenie szybkości przepływu gazu Zmniejszenie ilości próbki Dobór innej fazy stacjonarnej Zastosowanie programowanej temperatury

Chromatogramy gazowe

Chromatografia gazowa Zalety Wady Doskonała rozdzielczość Krótki czas analizy Niewielka ilość próbki Dobre systemy detekcji Oznaczenia ilościowe Substancje muszą być lotne i trwałe przy temperaturze 250-300°C

Jakie składniki żywności można analizować metodą GC? Substancje lotne i trwałe w temp. 200-300C związki zapachowe, olejki eteryczne, lipidy, alkaloidy Lotne pochodne nielotnych lub nietrwałych termicznie związków polarnych estry kwasów tłuszczowych, pochodne aminokwasów, pochodne monosacharydów 23 marca 2018

Aparaty GC-MS

Na czym polega spektrometria mas?

Paraksantyna (metabolit kofeiny) Spektrometria mas O C H 3 Spektrometer masowy H C C N 3 N C C H C C O N N H Paraksantyna (metabolit kofeiny) (~1 nanogram) Mass Spectrum 194 67 109 Abundance 55 82 42 94 136 165 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Mass (amu)

identyfikacji związku tym, czym odcisk linii papilarnych podczas Widmo masowe jest dla identyfikacji związku tym, czym odcisk linii papilarnych podczas identyfikacji przestępcy C6H14 C6H12

Schemat chromatografu cieczowego Elementy: Zbiornik fazy ruchomej Pompa Dozownik Kolumna Detektor Komputer

Chromatografy cieczowe

Elementy chromatografu cieczowego kolumna dozownik

Jakie składniki żywności można analizować metodą HPLC? Substancje polarne, nielotne, rozpuszczalne w wodzie (hydrofilowe), aminokwasy, peptydy, sacharydy, składniki mineralne, witaminy, pigmenty Substancje niepolarne, nierozpuszczalne w wodzie (lipofilowe) lipidy, kwasy tluszczowe, alkaloidy, witaminy Pochodne substancji lotnych lub nietrwałych

Chromatogram witamin rozpuszczalnych w wodzie 2. Pirydoksyna 1. Niacyna 3. Ryboflawina 4. Tiamina

Chromatogram mieszaniny 30 aminokwasów

Aparat LC-MS

Zastosowania HPLC w analizie żywności Identyfikacja i oznaczenia ilościowe składników żywności, badanie zmian składu podczas przechowywania oraz w trakcie procesów technologicznych Weglowodany Nukleozydy Aminokwasy, peptydy, białka Aflatoksyny Witaminy Antyoksydanty Kwasy tłuszczowe, triacyloglicerole Zanieczyszczenia Lipidy Naturalne i syntetyczne barwniki

Spektroskopia w podczerwieni (IR) Zakres promieniowania IR λ=2.5x10-4 cm - 2.5x10-3 cm /// 2,5 - 25μm ν = 4000 - 400 [cm-1] (liczba falowa)

Jakie zmiany w czasteczkach organicznych następują po absorpcji promieniowania podczerwonego? Drgania rozciagające Drgania zginające zmiana długości wiązań – drgania rozciągające zmiana kątów między wiązaniami – drgania zginające

Widmo IR Transmisja (%) Liczba falowa Analiza widma IR pozwala potwierdzić lub wykluczyć obecność grup funkcyjnych w badanym związku

Charakterystyczne zakresy widma IR 600-1500 cm-1 zakres daktyloskopowy 1500- 2000 cm-1 wiązania C=C, C=O, C=N 2000-2500 cm-1 wiązania C≡C, C≡N 2500-4000 cm-1 wiązania C-H, N-H, O-H

cycloheksan 2850-3000 cm-1 rozciągające 1350-1470 cm-1 zginające cycloheksen 1630-1680 cm-1 rozciągające 3020-3100 cm-1 rozciągające 2850-3000 cm-1 rozciągające 1350-1470 cm-1 zginające benzen 3020-3100 cm-1 rozciągające 1500 cm-1 rozciagające 690-900 cm-1 zginające

=>

Stretching Vibrations Analiza widm IR Typical Infrared Absorption Frequencies Stretching Vibrations Bending Vibrations Functional Class Range (cm-1) Intensity Assignment Alkanes 2850-3000 str CH3, CH2 & CH 2 or 3 bands 1350-1470 1370-1390 medmed CH2 & CH3 deformation CH3 deformation Alkenes 3020-3100 1630-1680 1900-2000 Med. var =C-H & =CH2 (sharp) C=C (symmetry reduces intensity) C=C asymmetric stretch 880-995 780-850 675-730 Str med =C-H & =CH2 (out-of-plane bending) cis-RCH=CHR Alkynes 3300 2100-2250 C-H (usually sharp) C≡C (symmetry reduces intensity) 600-700 C-H deformation Arenes 3030 1600 & 1500 Var med-wk C-H C=C (in ring) (2 bands) (3 if conjugated) 690-900 str-med C-H bending & ring puckering Alcohols & Phenols 3580-3650 3200-3550 970-1250 O-H (free), usually sharp O-H (H-bonded), C-O 1330-1430 650-770 var-wk O-H bending (in-plane) O-H bend (out-of-plane)

Stretching Vibrations Analiza widm IR Typical Infrared Absorption Frequencies Stretching Vibrations Bending Vibrations Functional Class Range (cm-1) Intensity Assignment Amines 3400-3500 (dil. soln.) 3300-3400 (dil. soln.) 1000-1250 Wk med N-H (1°-amines) N-H (2°-amines) C-N 1550-1650 660-900 Med. var NH2 sciss1°amines) NH2 & N-H wagging (shifts on H-bonding) Aldehydes, ketones 2690-2840(2 bands) 1720-1740 1710-1720 1690 1675 1745 1780 Med Str C-H (aldehyde C-H) C=O (sat. aldehyde) C=O (sat, ketone) aryl ketone α, β-unsaturation Cyclopentanone cyclobutanone 1350-1360 1400-1450 1100 str str med. α-CH3 bending α-CH2 bending  C-C-C bending Carboxylic Acids and Derivatives 2500-3300 (acids) overlap C-H 1705-1720 (acids) 1210-1320 (acids) 1785-1815 ( acyl halides) 1750 & 1820 (anhydrides) 1040-1100 1735-1750 (esters) 1000-1300 1630-1695(amides) med-str str O-H (very broad) C=O (H-bonded) O-C (2-peaks) C=O C=O (2-bands) O-C O-C (2-bands) C=O (amide I band) 1395-1440 1590-1650 1500-1560 C-O-H bending N-H (1¡-amide) II band N-H (2¡-amide) II band Nitriles 2240-2260 C≡N (sharp)