Zakresy promieniowania Światło widzialne podczerwień ultrafiolet Wektor pola elektrycznego Wektor pola magnetycznego TV AM/FM długość fali, l

Podział fal elektromagnetycznych Promieniowanie X Fale wolnozmienne- sieci przesyłowe Fale radiowe i TV okresowe zmiany kierunku i prędkości grup elektronów Ultrafiolet Promieniowanie gamma - powstaje w wyniku przemian jądrowych Podczerwień Widzialne Mikrofale Przejścia elektronów pomiędzy orbitami

Zastosowanie metod optycznych do badania układów biologicznych Nie inwazyjne Nie niszczące Badania in situ Spektroskopia optyczna Struktura biomolekuł Oddziaływania międzycząsteczkowe Badanie reakcji biochemicznych Mikroskopia optyczna Obrazowanie tkanek, komórek i organelli komórkowych

Zastosowanie spektroskopii optycznej do badania makromolekuł Absorpcja UV i widzialna Fluorescencja Światło spolaryzowane fluorescencja dichroizm liniowy i kołowy Spektroskopia wibracyjna podczerwień Raman Spektroskopia terahertzowa

Pochłanianie światła przez roztwory Podczas przechodzenia wiązki światła przez roztwory można zaobserwować kilka procesów mających wpływ na pochłanianie światła w próbce. - pochłanianie światła przez roztwór Ia - rozproszenie światła (do przodu) w kierunku jego przechodzenia Irp -rozproszenie światła do tyłu Ib -rozproszenie światła na boki Ir -część światła ulega odbiciu na granicy środowisk powietrze-szkło oraz szkło-woda In -część światła przechodzi przez roztwór It Ir Irp Ib Ia It I0 Ir I0 = It + Ib + Ir + Ia

Zjawisku absorpcji powoduje osłabienie natężenia światła monochromatycznego przechodzącego przez badany ośrodek. Dla roztworów o niewielkim stężeniu współczynnik absorpcji k jest proporcjonalny do stężenia c. Jest to prawo Beera, które zapisujemy wzorem k = e c gdzie e to współczynnik ekstynkcji, wartość charakterystyczna dla danego roztworu Dla roztworów jednorodnych dla których współczynnik absorpcji k nie zależy od położenia natężenie światła wychodzącego It z próbki o grubości d wynosi It = I0 exp (-kd) co stanowi treść prawa Lamberta. Łącząc obydwie zależności otrzymujemy prawo Lamberta-Beera w postaci wzoru I = I0 exp (-ecd)

-dI = I0 e c dx zmiana natężenia –dI na grubości dx I - dI It It = I0 exp(-ecl) dx l Po zlogarytmowaniu wyrażenia oraz pomnożeniu przez (–1) otrzymamy wyrażenie na absorbancję A I A = ecl A = - log T T = 10-A absorbancja T - transmisja

Współczynnik ekstynkcji e A = ecl Wartość współczynnika ekstynkcji w maksimum absorpcji jest wartością charakterystyczną dla każdego związku. Na podstawie widma absorpcji oraz znanego współczynnika ekstynkcji możemy obliczyć stężenie molowe danego związku w roztworze. Dzięki addytywności współczynników ekstynkcji można określić udział poszczególnych składników w roztworze Al = AlM + AlN = ( elM [M] + elN [N]) l

Spektroskopia absorpcyjna Elektronowe widmo absorpcji Stan wzbudzony W wszystkie molekuły znajdują się w wibracyjnym stanie podstawowym podstawowego stanu elektronowego Przejścia z i do wibracyjnych poziomów elektronowych stanów wzbudzenych Stan podstawowy Przejścia pomiędzy stanami wibracyjnymi Stan podstawowy to stan singletowy (spiny sparowane S=1) Dozwolone przejścia do stanów singletowych

Widmo absorpcji wody

gaz idealny gaz rzeczywisty ciecz Dla molekuł wieloatomowych W woda; D dioksan; C cykloheksan gaz idealny absorbancja absorbancja gaz rzeczywisty ciecz długość fali, nm długość fali, nm Oddziaływania z rozpuszczalnikiem zakłócają poziomy energetyczne Dla molekuł wieloatomowych pojedyncze przejścia wibracyjne nie są obserwowane. Prowadzi to do poszerzenia lub/i przesunięcia widm W cieczach obserwuje się poszerzenie i nakładanie się poszczególnych pasm

bacteriochlorophyll chlorophyll A chlorophyll B phycoerythroblin beta carotene

Chromofory hipochromizm hiperchromizm Oddziaływania pomiędzy wieloma chromoforami prowadzi do zmiany widm oraz intensywności pasm Grupy funkcjonalne posiadające charakterystyczne widmo absorpcji Grupa amidowa Najniższe przejścia energetyczne mogą zmieniać natężenie w zależności od geometrii i konformacji chromofrorów Aromatyczne aminokwasy Tryptofan, tyrozyna, alaniana Zmniejszenie natężenia pasma hipochromizm Zwiększenie natężenia pasma hiperchromizm Zasady kwasów nukleinowych

Spektroskopia wiązania amidowego Cztery nie-wiążące n elektrony na tlenie Cztery p elektrony Silne pasmo pp przy 195 nm Słabe pasmo np przy 220 nm Widmo absorpcji chromoforu amidowego

Oddziaływania pomiędzy chromoforami Białka zawierają wiele grup amidowych Widma absorpcji amino kwasów Przejściowe momenty dipolowe grup amidowych oddziaływają ze sobą FAl Tyr Dwie grupy amidowe w dimerze białka Oddziaływania kulombowskie pomiędzy grupami Trp Siła oddziaływania zależy od wielkości dipoli, Względnej orientacji oraz odległości, zależność R-3

Spektroskopia absorpcyjna chromoforów białek Wiele wiązań peptydowych (amidowych) z różnymi podstawnikami Przeważającym chromoforem jest grupa amidowa Słabe np przejście około 220 nm Silne pp przejście około 195 nm Większość łańcuchów bocznych wykazuje przejścia poniżej 200 nm Zwykle przykrytych przez silną absorpcję grupy amidowej Aminokwasy aromatyczne tyrozyna, tryptofan fenyloalanina Mają pasmo absorpcji około 300 nm

Spektroskopia absorpcyjna białek Widmo absorpcji albuminy Charakterystyczne pasmo grupy amidowej 200 nm Drugi pik około 280 nm związany z obecnością podstawnik aromatycznego A Widmo charakterystyczne pozwalające odróżnić białka od DNA nm Wstępna identyfikacja białek w badanym materiale, np. w chromatografii

Drugorzędowa struktura białek Widmo UV jest czułe na drugorzędową strukturę białek Struktura helikalna (1), pofałdowana (2) i kłębek statystyczny (3) Posiadają różne własności absorpcyjne Pozwala to na śledzenie zmian w strukturze drugorzędowej podczas zmian warunków wykrywać denaturację 3 2 Różne widma ze względu na różne oddziaływania pomiędzy chromoforami Kłębek statystyczny praktycznie widmo grupy amidowej 1 Helikalna - regularnie ułożone, oddziaływujące grupy amidowe Widmo rozdzielone, natężenie zmniejszone

Spektroskopia absorpcyjna kwasów nukleinowych Chromofory Zasady kwasów nukleinowych intensywne przejścia typu pp Wszystkie mają podobne widma UV

Mały zakres wartości absorbancjii Pomiary stężeń molekuł biologicznych za pomocą absorpcji Małe stężenia, mała dokładność ważenia Obecność wody i soli Mały zakres wartości absorbancjii Współczynniki ekstynkcji Pomiar względem próbki referencyjnej Białko e190 x 103 Prawo Lambert-Beera A = e c l

Zjawisko fluorescencji – schemat Jabłońskiego

Luminescencja Fotoluminescencja Emisja światła przez elektronowo wzbudzoną molekułę Fluorescencja to fotoluminescencja Molekuła wzbudzona w wyniku absorpcji światła optyczne wzbudzenie Fotoluminescencja Inne rodzaje luminescencji fluorescencja chemiluminescencja przejścia z zachowaniem spinu bioluminescencja czas trwania od piko do nanosekunds elektroluminescencja tryboluminescencja fosforescencja mechanicznie indukowane rozładowania elektryczne przejścia spinowo zabronione czas trwania mili do sekund

Molecular Probes Inc, www.probes.com Spektroskopia fluorescencyjna Obecnie najczęściej używana technika spektroskopowa w biologii Wiele biomolekuł wykazuje naturalną fluorescencję Chlorofil czerwona Białka – fluorescencja w zakresie UV głównie z reszt tryptofanowych Modyfikowane zielono fluoryzujące białka GFP DNA fluorescencja w UV Sondy fluorescencyjne do badania nie fluoryzujących biomolekuł Molecular Probes Inc, www.probes.com

czas życia fluorescencji Dlaczego fluorescencja jest tak użyteczna? Wysoka czułość Możliwość wykrywania pojedynczych molekuł Duża selektywność Trzy charakterystyczne parametry długość fali wzbudzenia długość fali emisji czas życia fluorescencji Czuła na molekularne otoczenie Czuła na oddziaływania międzycząsteczkowe Transfer energii elektronowej Molekularna linijka

Molekuły chiralne Nie można poprzez obrót otrzymać cząsteczki wyjściowej Symetria zwierciadlana

Widma dichroizmu kołowego, CD Dichroizm kołowy jest to różnica w absorpcji kołowo spolaryzowanego światła lewo- i prawoskrętnie przez cząsteczkę asymetryczna lub chirialną. W białkach chromoforem jest grupa amidowa absorbująca w zakresie 160 – 240 nm Chiralność białek jest związana z niesymetrycznym Atomem węgla Ca Widma CD dostarczają informacji na temat drugorzędowej struktury białek oraz DNA gdyż różne struktury wykazują różniące się widma

CD białek Widma dichroizmu kołowego są bardziej specyficzne niż widma absorpcji

Powstawanie obrazu

Budowa i zasada działania mikroskopu

Apertura numeryczna

Powiększenie 250x można otrzymać przez kombinacje Wybór kombinacji okular/obiektyw w celu otrzymania optymalnego powiększenia obiektu. Powiększenie 250x można otrzymać przez kombinacje 25x okular / 10x obiektyw lub 10x okular / 25x obiektyw Obiektyw 25x ma większą aperturę numeryczna (0.65) niż obiektyw 10x (0.25) Apertura numeryczna definiuje rozdzielczość obiektywu wobec tego drugi wybór jest lepszy Pierwszy przypadek prowadzi do tzw. pustego powiększenia i zmniejszenia rozdzielczości Rozdzielczość kątowa oka wynosi około 2 min co przy odległości czopków w oku ok.. 5 mm Daje liniową rozdzielczość około 0.15 mm