Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Niewirusowe (syntetyczne) nośniki DNA Magdalena Dudek Paulina Kucharzewska.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Niewirusowe (syntetyczne) nośniki DNA Magdalena Dudek Paulina Kucharzewska."— Zapis prezentacji:

1 Niewirusowe (syntetyczne) nośniki DNA Magdalena Dudek Paulina Kucharzewska

2 Metody wprowadzania transgenu (genu reporterowego lub terapeutycznego) oraz syntetycznych oligonukleotydów do komórek docelowych: - fizyczna (mikroiniekcja, elektroporacja, metoda biolistyczna – strzelba genowa), - chemiczna (DEAE-dekstran, Ca 2+, syntetyczne nośniki DNA) - wirusowe (adenowirusowe, AAV, retrowirusy i inne). Metody transfekcji

3 Syntetyczne nośniki DNA Grupę niewierusowych nośników DNA tworzą różne związki chemiczne i struktury ponadmolekularne (supramolekularne) obdarzone ładunkiem dodatnim: - lipidy i liposomy kationowe - LIPOPLEKSY - kationowe polipeptydy i białka - polimery i kopolimery kationowe, - dendrymery POLIPLEKSY

4 Liposomy to sferyczne, dwuwarstwowe struktury składające się z cząsteczek lipidu obdarzonego ładunkiem + i cząsteczek lipidu obojętnego elektrostatycznie. Lipidy i liposomy kationowe DOTMA (lipofektyna) DOPE (L-dioleilofosfatydyloetanoloamina) obojętny lipid

5 Kationowe polipeptydy i białka - poli- L-lizyna (PLL) - poli- L- ornityna - białka np. protamina, histony, ludzka albumina

6 Polimery i kopolimery kationowe Syntetyczne polimery kationowe Naturalne polimery kationowe chitozan rozgałęziona PEI poli – β aminoestry

7 Dendrymery Dendrymery to wysokocząsteczkowe polimery o dobrze zdefiniowanej architekturze i wyróżniające się jednorodnością i rozkładem ładunków, np. polimery poliamidoaminowe (PAMAM). rdzeń (amoniak, D-glukoza) grupy funkcyjne

8 Zalety niewierusowych nośników DNA brak ograniczenia wielkości transgenu brak integracji z genomem małe ryzyko rekombinacji genetycznej możliwe podawanie systemowe możliwość transfekowania wielu typów komórek nie powodują odczynu zapalnego i mogą być wielokrotnie stosowane

9 Pożądane właściwości niewirusowych nośników: - biokompatybilność (brak toksyczności i immunogenności, stabilność in vivo) - łatwe w podawaniu klinicznym, bez powikłań genetycznych (mutagenności) i odpowiedzi układu odpornościowego, - niewygórowany koszt i prosty schemat syntezy, - produkowane w dużej ilości z dużą wydajnością - stabilne w czasie przechowywania, - wysoka wydajność transfekcji komórek, - wysoka specyficzność transfekcji

10 Bariery uniemożliwiające obecnie stosowanie kompleksów DNA-syntetyczne nośniki w terapii: 1. Produkcja, formowanie i stabilność. 2. Bariery pozakomórkowe: - opsoniny - komórki fagocytujące - macierz pozakomórkowa - enzymy trawienne 3. Bariery wewnątrzkomórkowe: - błona komórkowa - endosomy/lizosomy - błona jądrowa

11 Produkcja, formowanie i stabilność stosunek nośnik kationowy/DNA - określa on rozmiar kompleksu i jego powierzchniowy ładunek (rozmiar kompleksu a wydajność pobierania w drodze endocytozy) stabilność podczas przechowywania – liofilizacja polipleksów i lipopleksów w obecności substancji ochronnych (cukry) steryczna stabilizacja nośników - niewirusowe nośniki w celach terapeutycznych muszą być stosowane w dużych stężeniach (agregacja i precypitacja). Rozwiązanie – kowalencyjne przyłączanie polietylenoglikolu (PEG) do lipopleksów i polipleksów cytotoksyczność wysokocząsteczkowych nośników (PEI800 – uszkodzenie błony komórkowej)– stosowanie niskocząsteczkowych polikationów np. chitosan, PEI25

12 1. Dotarcie DNA do powierzchni komórki 2. Związanie się kompleksu zawierającego DNA do błony komórkowej 3. Przejście kompleksu przez błonę 4. Przejście DNA przez cytoplazmę 5. Wejście DNA do jądra komórkowego 6. Umiejscowienie się DNA w odpowiednim miejscu w jądrze komórkowym Warunki udanego transferu genów do komórek

13 Bariera pozakomórkowa In vivo, w obecności osocza, kompleksy o wypadkowym ładunku dodatnim mają utrudniony dostęp do tkanek docelowych. Przyczyny: agregacja kompleksów w krwi, duży, dodatni ładunek odpowiedzialny za niespecyficzne oddziaływanie z macierzą zewnątrzkomórkową, powierzchnią wielu komórek, białkami osocza, opłaszczenie kompleksów przez białka osocza- opsoniny i ich eliminacja z krwiobiegu i płynów pozakomórkowych w wyniku fagocytozy przez komórki żerne w wątrobie i śledzionie, aktywacja układu dopełniacza i eliminacja nośników

14 Bariera pozakomórkowa Próby zwiększenia stabilności kompleksów nośnika z DNA w krwiobiegu: -utworzenie na zewnętrznej powłoce nośników niewirusowych warstwy hydrofilowej z kopolimerów np. kopolimer metakrylanowo-metakrylamidowy (HPMA) czy polietylenoglikol (PEG) przyłączone kowalencyjnie do kompleksów polilizyna/DNA nadają oporność na działanie białek surowicy i zapobiegają agregacji. PEG Stopień stabilizacji rośnie wraz z długością łańcucha polimeru oraz jego gęstością na powierzchni cząsteczek nośnika

15 -znaczne zwiększenie stabilności kompleksu kopolimer-DNA poprzez usieciowanie niektórych składników kopolimerowych na zewnętrznej warstwie kompleksu np. nośnik oparty na poli-L-lizynie, której I-rzędowe grupy aminowe usieciowane są za pomocą czynnika sprzęgającego dimetylo-3,3-ditiobispropionoimidu (DTBP), kompleks ten dodatkowo jest pokryty PEG maskującym ładunek i zwiększającym rozpuszczalność kompleksu. DTBP Bariera pozakomórkowa mostki disiarczkowe ulegające redukcji w cytoplazmie zmniejszają stabilizację całego kompleksu i umożliwiają uwalnianie DNA

16 Bariera pozakomórkowa Zwiększenie specyficzności transfekcji komórek za pomocą nośników zawierających swoiste ligandy dla receptorów na powierzchni komórek docelowych : - nośnik lipidowo-peptydowy złożony z liposomów kationowych oraz cząsteczek peptydu z trójaminokwasowym motywem RGD (oddziaływanie nośnika z receptorami integrynowymi powierzchni komórek), - nośniki z mannozylową pochodną cholesterolu (man-C4- Chol) – wydajna transfekcja komórek z receptorami dla mannozy np.makrofagi, - kationowy polimer poli-L-lizyna/galaktoza – wydajna transfekcja in vivo komórek z receptorami asjaloglikoproteinowymi (np. hepatocyty), - nośniki z ligandem w postaci transferyny – wydajna transfekcja komórek nowotworowych. Ligandy dołączone do końca długich linkerów (łączników) np. PEG

17 Bariera wewnątrzkomórkowa Lipopleksy i polipleksy łączą się z daną komórką za sprawą oddziaływań z ujemnie naładowanymi proteoglikanami na powierzchni komórek, bądź za sprawą receptorów dla ligandów obecnych na powierzchni nośników. Oba mechanizmy prowadzą do pobrania tych związków przez komórkę na drodze endocytozy.

18 Bariera wewnątrzkomórkowa Stabilność i losy endosomu ENDOCYTOZA endosmoliza fuzja z lizosomem (aktywacja enzymów litycznych uwolnienie kompleksu do cytoplazmy zniszczenie kompleksu i degradacja terapeutycznego DNA

19 Bariera wewnątrzkomórkowa Wydajność uwalniania kompleksów nośnik-DNA z endosomów do cytoplazmy jest uzależniona od obecności w nośniku składnika zdolnego do destabilizacji błony endosomu. Wykorzystywane czynniki fuzyjne: - w liposomach – fosfatydyloetanoloamina (DOPE), - podjednostki pewnych toksyn bakterii z rodzaju Diphteria i Pseudomonas, - elementy strukturalne niektórych wirusów np. białka kapsydu adenowirusa albo fragment hemaglutyniny wirusa grypy. Inne związki: -melityna (kationowy peptyd, główna toksyna jadu pszczelego o własnościach litycznych), - polietylenoimina PEI – przy spadku pH z 7 do 5 stopień protonacji PEI wzrasta z 20 do 45% - napływ jonów Cl - i osmotyczne pęcznienie endosomów (efekt gąbki protonowej)

20 Bariery wewnątrzkomórkowe Wejście transgenu do jądra komórki: - pasywne - plazmidowy DNA może wniknąć do jądra, podczas podziału komórki (łatwość transfekowania komórek intensywnie dzielących się) - aktywne – plazmidowy DNA związany z białkiem lub inna cząsteczką zawierającą sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) rozpoznawany przez receptory jądrowe z rodziny importyn

21 – konstrukcja nośników syntetycznych z wirusowymi sygnałami lokalizacji jądrowej w połączeniu z innymi białkami np. białko fuzyjne GAL4-NLS (GAL4 – drożdżowy czynnik transkrypcyjny) -ligandy: FGF i laktoza wydają się wpływać na lepszy transport polipleksów do jądra - sekwencje nukleotydowe wprowadzane do plazmidowego DNA (sekwencje najwyższej zgodności dla czynników transkrypcyjnych) Zwiększenie wydajności transferu transgenu do jądra

22 Literatura: M.E. Davis, Non-viral gene delivery systems, Current Opinion in Biotechnology, 13: , 2002 M.Thomas, A.M. Klibanov, Non-viral gene therapy: polycation-mediated DNA delivery, Appl Microbiol Biotechnol, 62:27-34, 2003 S. Szala, Terapia genowa, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

23 DZIĘKUJEMY ZA UWAGĘ


Pobierz ppt "Niewirusowe (syntetyczne) nośniki DNA Magdalena Dudek Paulina Kucharzewska."

Podobne prezentacje


Reklamy Google