Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Sample & Assay Technologies QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Sample & Assay Technologies QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska."— Zapis prezentacji:

1 Sample & Assay Technologies QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska

2 Sample & Assay Technologies M. tuberculosis Genom M. tuberculosis zawiera 4000 genów 104 geny nieobecne w szczepionce BCG 40 genów niewystępujących u innych Mycobacteria 6-8 silnie immunogenne

3 Sample & Assay Technologies Antygeny specyficzne dla M. tuberculosis kodowane przez RD Antygeny typowo gruźlicze Antygeny M.tuberculosis Antygeny w szczepionce BCG Antygeny innych mycobacteria

4 Sample & Assay Technologies Wybór antygenów ESAT-6 (early secreted antigenic target 6 kD protein) i CFP-10 (culture filtrate protein 10 ) oraz peptyd TB7.7 (Rv2645, d-ribose, 5-phosphate isomerase) ESAT-6 i CFP-10 swoiste dla gruźlicy ( swoistość 99.2%, QFT Gold Package Insert (US) ) TB7.7(p4) bardzo wysoka swoistość (534/535; 99.8% - potwierdzona w testach) 20 do 30% odpowiedzi wśród pacjentów zakażonych Antygeny w probówce Dodatkowy (synergiczny) efekt wzmacnia odpowiedź Nakładające się peptydy (10aa) długości 25merow Zminimalizowane ryzyko kontaminacji (np. endotoksyny) oraz kontrola jakości przeprowadzonego testu Długie peptydy o >95% czystości, by zmierzyć odpowiedz CD4 Można użyć krótszych lub mniej oczyszczonych peptydów i mierzyć także odpowiedź CD8, ale rola tych komórek w diagnostyce jest niejasna

5 Sample & Assay Technologies RD1 Locus i ESX-1 System Ernst JD, et al. J Clin Invest 2007;117: ESAT-6 oraz CFP-10 są wydzielane jako dimer

6 Sample & Assay Technologies ESAT-6, CFP-10 i TB7.7(p4) kodowane przez geny RD nie występują w szczepionce BCG nie występują u większości NTM indukują odpowiedź IFN- Właściwości specyficzne dla antygenów gruźliczych

7 Sample & Assay Technologies BCG Historical Genealogy Science 1999;284: Loss of RD 1 region in BCG

8 Sample & Assay Technologies QFT: brak reakcji krzyżowej z BCG/TST Tuberculosis Complex ESAT-6CFP-10TB-7.7 Environmental Strains ESAT-6CFP-10TB-7.7 M. tuberculosis +++ M. abcessus --- M. africanum +++ M. avium --- M. bovis +++ M. branderi --- M. celatum --- BCG SubstrainESAT-6CFP-10TB-7.7 M. chelonae --- Gothenberg --- M. fortuitum --- Moreau --- M. gordonii --- Tice --- M. intracellulare --- Tokyo --- M. kansasii ++- Danish --- M. malmoense --- Glaxo --- M. marinum ++- Montréal --- M. oenavense --- Pasteur --- M. scrofulaceum --- M. smegmatis --- M. szulgai ++- M. terra --- M. vaccae --- M. xenopi ---

9 Sample & Assay Technologies Mechanizm immunologiczny w technologii QFT U osób zakażonych prątkiem gruźlicy limfocyty reagują odpowiedzią imunnologiczną na antygeny gruźlicze Technologia QuantiFERON ® wykorzystuje stymulację próbek krwi specyficznymi antygenami Komórka prezentująca antygen (APC) napotyka antygen który wchłania i trawi

10 Sample & Assay Technologies Mechanizm immunologiczny w technologii QFT W odpowiedzi na stymulacje antygenami limfocyty T wydzielają interferon gamma Technologia QuantiFERON ® pozwala zmierzyć poziom sekrecji IFN- jako narzędzie do wykrywania zakażenia APC prezentuje antygen limfocytom T Aktywowane limfocyty T wydzielają IFN- γ.

11 Sample & Assay Technologies Nowoczesna diagnostyka zakażenia gruźliczego mierzy IFN- IFN- CMI (Cellular Mediated Immune Response) Limfocyty T wydzielają IFN- po stymulacji przez antygeny Mierzalna sekrecja Nie występuje w krążeniu

12 Sample & Assay Technologies Odpowiedź immunologiczna podczas infekcji TB Modified from Anderson P et al. Trends Mol Med. 2007; 13: Już w 2 tygodnie po infekcji można zmierzyć CMI. Wykrycie antygenów i przeciwciał jest możliwe dopiero w aktywnym stadium gruźlicy. Szary obszar = mierzalna odpowiedz w teście diagnostycznym

13 Sample & Assay Technologies D:\Users\MSokolowska\Desktop\QuantiFERON TB Product Overview PL2.pptx

14 Sample & Assay Technologies QFT probówki do pobrania krwi i odczynniki ELISA

15 Sample & Assay Technologies Etap 1. Pobranie krwi Pobierz 1ml do każdej probówki. Przytrzymaj probówkę na igle przez 2-3 sekundy po zaprzestaniu przepływu.

16 Sample & Assay Technologies Pobranie krwi Krew należy pobierać w temp ºC Dopuszczalna objętość krwi w probówce 0.8 – 1.2 ml

17 Sample & Assay Technologies Pobranie krwi Czarna linia na etykiecie wskazuje 1ml objętości. Jeśli poziom krwi w każdej probówce nie jest zbliżony do linii wskaźnikowej, zaleca się ponowne pobranie.

18 Sample & Assay Technologies 2) Wstrząsanie probówek Natychmiast po napełnianiu probówek, wstrząsnąć je 10 razy Wstrząsnąć wystarczająco mocno, aby zapewnić pokrycie całej wewnętrznej powierzchni probówki

19 Sample & Assay Technologies Wstrząsanie probówek Uwaga! - Zbyt mocne wytrząsanie może powodować oderwanie żelu i może prowadzić do nieprawidłowych wyników.

20 Sample & Assay Technologies 3) Inkubacja/Transportowanie: Opcja :1Inkubacja w miejscu pobierania Inkubować w miejscu pobierania (pionowo w temperaturze 37 ° C przez godziny) Następnie przesłać do laboratorium w temperaturze 4 – 27 ° C Opisać jako "inkubowane"

21 Sample & Assay Technologies Inkubacja/ Trasportowanie: Opcja 2: Inkubacja w laboratorium Właściwy transport do laboratorium w °C Krew musi być inkubowana w temperaturze 37 ° C, tak szybko jak to możliwe i nie później niż 16 godzin od pobrania Opisać jako "nie inkubowane"

22 Sample & Assay Technologies CHEST 2012

23 Sample & Assay Technologies Flow diagram for study selection: inclusion and exclusion criteria for relevant citations

24 Sample & Assay Technologies Wartość predykcyjna IGRA dla progresji do gruźlicy we wszystkich badanych populacjach w % (komercyjne IGRA)

25 Sample & Assay Technologies Higuchi (0.00 – 0.04) 0/95 Bakir (0.01 – 0.10) 3/83 Hill (0.01 – 0.03) 14/843 Lee (0.00 – 0.25) 1/20 Higuchi (0.00 – 0.03) 0/200 Kik (0.01 – 0.05) 8/288 Diel (0.02 – 0.05) 17/555 Harstad (0.01 – 0.03) 6/415 Leung (0.03 – 0.12) 9/136 Thomas (0.00 – 0.04) 0/100 Song (0.02 – 0.13) 6/99 Chang (0.00 – 0.21) 0/16 Lienhardt (0.01 – 0.04) 16/629 Silvermann (0.00 – 0.26) 0/12 Torres Costa Mahomed (0.00 – 0.00) 4/ (0.01 – 0.02) 40/2894 PPV (95% CI) n/N Pooled PPV for progression = (0.012 to 0.017) Chi-square = 89.22; df = 15 (p = ) Inconsistency (I-square) = 83.2 % PPV for progression TST Wartość predykcyjna próby tuberkulinowej dla progresji do gruźlicy we wszystkich badanych populacjach w %

26 Sample & Assay Technologies PPV for progression commercial IGRAs Clark (0.01 – 0.32) 2/20 Aichelburg (0.02 – 0.22) 3/36 Haldar (0.11 – 0.26) 19/110 Kik (0.01 – 0.06) 5/178 Kik (0.01 – 0.07) 6/181 Lee (0.00 – 0.22) 0/15 Lee (0.00 – 0.38) 1/12 Diel (0.08 – 0.19) 19/147 Harstad (0.01 – 0.05) 6/238 Jonnalaggada (0.02 – 0.11) 6/110 Leung (0.04 – 0.13) 12/151 Kim (0.02 – 0.14) 4/71 Song (0.07 – 0.36) 6/32 Yoshiyama (0.04 – 0.14) 9/119 Zhang (0.00 – 0.21) 0/16 Pooled PPV for progression = (0.056 to 0.083) Chi-square = 50.30; df = 14 (p = ) Inconsistency (I-square) = 72.2 % PPV (95% CI) n/N Wartość predykcyjna IGRA dla progresji do gruźlicy w grupach ryzyka w %

27 Sample & Assay Technologies Higuchi (0.00 – 0.04) 0/95 Bakir (0.01 – 0.10) 3/83 Hill (0.01 – 0.03) 14/843 Lee (0.00 – 0.25) 1/20 Higuchi (0.00 – 0.03) 0/200 Kik (0.01 – 0.05) 8/288 Diel (0.02 – 0.05) 17/555 Harstad (0.01 – 0.03) 6/415 Leung (0.03 – 0.12) 9/136 Song (0.02 – 0.13) 6/99 Chang (0.00 – 0.21) 0/16 Lienhardt (0.01 – 0.04) 16/629 Silvermann (0.00 – 0.26) 0/12 PPV (95% CI) n/N Pooled PPV for progression = (0.019 to 0.029) Chi-square = 32.87; df = 12 (p = ) Inconsistency (I-square) = 63.5 % Wartość predykcyjna proby tuberkulinowej dla progresji do gruźlicy w grupach ryzyka w %

28 Sample & Assay Technologies Ujemna wartość predykcyjna IGRA dla predykcji progresji do gruźlicy we wszystkich badanych populacjach % (ujemny wynik IGRA)

29 Sample & Assay Technologies Negative predictive value for TST for predicting progression to TB disease in all study populations in %

30 Sample & Assay Technologies Head-to-head comparison of PPV of commercial IGRAs versus TST in untreated persons StudyYearSampleCountryn/N; IGRA (%)IGRA usedn/N; TST (%) PPV difference between IGRA and TST, percentage points Lee et al.2009Hemodialysis patientsTaiwan1/12 (8.3)QFT-G1/20 (5.0)+3.3 Lee et al.2009Hemodialysis patientsTaiwan0/15 (0.0)T-Spot1/20 (5.0)-5.0 Diel et al.2010Contact personsGermany19/147 (12.9)QFT-IT17/555 (3.1)+9.8 Harstad et al.2009Asylum seekersNorway6/238 (2.5)QFT-IT6/415 (1.4)+1.1 Kik et al.2010Contact personsNetherlands6/181 (3.3)T-Spot8/288 (2.8)+0.5 Kik et al.2010Contact personsNetherlands5/178 (2.8)QFT-IT8/288 (2.8) ±0.0 Leung et al.2010Silicosis patientsHong Kong12/151 (7.9)T-Spot9/136 (6.6)+1.3 Song et al.2011School contactsSouth Korea6/32 (18.8)QFT-IT6/99 (6.1)+12.7 Thomas et al.2011AdolescentsBangladesh0/107 (0.0)QFT-IT0/100 (0.0) ±0.0 Mahomed et al.2011AdolescentsSouth Africa39/2669 (1.5)QFT-IT40/2894 (1.4)+0.1 Torres Costa et al.2011Healthcare workersPortugal4/945 (0.4)QFT-IT4/2094 (0.2) /4675 (2.1)100/6909 (1.4)P = 0.01

31 Sample & Assay Technologies Wnioski: Łączna PPV dla progresji we wszystkich badaniach z użyciem komercyjnych testów IGRA wynosiła 2.7%. Łączna PPV dla progresji w badaniach z użyciem OT wyniosła 1.5%. PPV dla progresji w grupach wysokiego ryzyka badanych testem IGRA wynosiła 6.8%. PPV dla progresji w grupach wysokiego ryzyka z użyciem OT wyniosła 2.4% Łączna wartość NPV dla progresji w obu testach była bardzo wysoka: 99.7% i 99.4%, lecz znacząco wyższa dla IGRA [p<0.01].

32 Sample & Assay Technologies Wnioski: Wartość predykcyjna dla IGRA prawie 2x wyższa we wszystkich badaniach Wartość predykcyjna dla IGRA prawie 3x wyższa w grupach wysokiego ryzyka Ujemna wartość predykcyjna dla IGRA statystycznie wyższa Komercyjne testy IGRA potwierdziły wyższą wartość predykcyjną dla progresji do aktywnej gruźlicy w porównaniu do próby tuberkulinowej, szczególnie w grupach wysokiego ryzyka

33 Sample & Assay Technologies Dziękuję za uwagę.

34 Sample & Assay Technologies

35 Etap 1 – Stymulacja krwi i zebranie osocza Odwirować przy prędkości 2000 – 3000 g (RCF) przez 15 minut przed po Po odwirowaniu probówki mogą być przechowywane do 4 tygodni w temperaturze 2-8 °C (dłużej w -70)

36 Sample & Assay Technologies Etap 1 – Stymulacja krwi i zebranie osocza Próbki mogą być pobierane bezpośrednio z probówek ręcznie W platformach automatycznych

37 Sample & Assay Technologies

38 iii. ELISA

39 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Wyjąć odczynniki z lodówki na 1 godz przed rozpoczęciem badania (17-27 stopni Celsjusza) Koniugat musi pozostać w lodowce

40 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Rozpuścić standard w objętości wody destylowanej wskazanej z boku fiolki (do stężenia końcowego 8 IU/mL) Rozpuścić 100x stężony koniugat w 300μL wody destylowanej

41 Sample & Assay Technologies Poza USA QuantiFERON jest oparty na 4-punktowej krzywej wzorcowej In the US the FDA has approved an 8-pt curve, but indicated that an alternative dilution series may be used as long as it has been validated by the laboratory. Consequently, it is acceptable to adhere to the 4-pt instructions in the US as well. The interpretation criteria for QuantiFERON are the same for both standard curves. Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) 4-punktowa krzywa wzorcowa

42 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) 150 L (standard wyjsciowy) 8.0 IU/mL Standard 4 0 IU/mL (tylko GD) Standard IU/mL Standard IU/mL Standard IU/mL 50 L S3S4S2 Przygotowanie krzywej wzorcowej

43 Sample & Assay Technologies Stage 2 – Human IFN- γ ELISA Prepare standard curve as per the Package Insert 8-point curve for 3G (US-version) Reconstituted Kit Standard Standard 8 (Green Diluent) (zero) Standard IU/mL Standard IU/mL Standard IU/mL Standard IU/mL Standard IU/mL Standard IU/mL Standard IU/mL 150 L 300 L

44 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Przygotować koniugat roboczy wg instrukcji Dodać 50μL koniugatu roboczego do każdego dołka

45 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Dodać 50μL osocza i wzorca do odpowiednich dołków

46 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Wytrząsać płytkę przez 1 minutę

47 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Inkubować 120 minut w temperaturze 22 ± 5ºC Z dala od działania światła i ciepła

48 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Wypłukać płytkę 6 razy Usunąć pozostały bufor płuczący wystukujac płytkę o ręcznik papierowy Dodać 100µL substratu enzymu

49 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Wytrząsać płytkę przez 1 minutę

50 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Inkubować 30 minut w temperaturze 22 ± 5ºC Z dala od słońca i źródeł ciepła

51 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Dodać 50μL roztworu hamującego do każdego dołka

52 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Odczytać poziom OD dla filtra 450nm i 620 – 650nm jako referencji

53 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Płytki QFT sa pokryte przeciwciałami anty-INF Anti-Human IFN- γ Antibody

54 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Anti-Human IFN- γ AntibodyAnti-Human IFN- γ Antibody Conjugated to HRP

55 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Anti-Human IFN- γ AntibodyAnti-Human IFN- γ Antibody Conjugated to HRP IFN- γ

56 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Jeśli IFN- γ jest obecny, przeciwciała tworzą kompleksy, a niezwiązany materiał jest wymywany Anti-Human IFN- γ AntibodyAnti-Human IFN- γ Antibody Conjugated to HRP IFN- γ

57 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Po dodaniu substratu: –IFN-γ obecny zmiana koloru na niebieski –brak IFN- γ brak zmiany koloru

58 Sample & Assay Technologies Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) Po dodaniu roztworu hamującego –IFN-γ obecny zmiana koloru na żółty –Brak IFN- γ brak zmiany koloru

59 Sample & Assay Technologies Analiza danych z oprogramowaniem QFT

60 Sample & Assay Technologies Etap 2 – ELISA - wyniki Obliczenia wyników przy użyciu oprogramowania do analizy QuantiFERON ®

61 Sample & Assay Technologies Wychadzac od krzywej wartość INF γ w IU/mL może być ustalona dla każdej próbki OD Teoria Oprogramowanie używa pomiarów OD S1 – S3 do generowania krzywej wzorcowej S1 S2 S3 Sample IU/mL IFN- γ (IU/mL) OD Sample OD

62 Sample & Assay Technologies S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 IFN- γ (IU/mL) OD Sample IU/mL Sample OD From this curve an IFN-γ IU/mL value can be determined for each sample OD Theory Software uses the ODs of S1 – S7 to generate a standard curve (US-version)

63 Sample & Assay Technologies Tabela szczegółowych wyników Operator Data Nr testu Nr seryjny

64 Sample & Assay Technologies Wklej dane Tabela danych wyjsciowych Wybierz przycisk domyślny Format (lub wybierz ręcznie lub za pomocą przycisku "Poprzedniego formatu") Opisz probki Oblicz wyniki

65 Sample & Assay Technologies Obejmuje OD i % CV dla każdego z punktów krzywej wzorcowej Kontrola jakości Wykreślenie krzywej Prawidłowe lub nieprawidłowe ELISA Współczynnik korelacji

66 Sample & Assay Technologies Wyniki w IU/mL dla każdego badanego Tabela wynikow

67 Sample & Assay Technologies Raporty mogą być drukowane lub zachowywane jako pliki pdf zbiorczo indywidualnie Funkcje dodatkowe Eksport danych i wyników

68 Sample & Assay Technologies Skrócony przewodnik po oprogarmowaniu

69 Sample & Assay Technologies Selecting New Test returns to the Run Details tab all information is remembered, except for the Run Number Further Analysis Allows easy analysis of multiple plates

70 Sample & Assay Technologies QuantiFERON ® -TB Gold Trouble Shooting

71 Sample & Assay Technologies Problem Solving Blood Incubation and Plasma Harvesting Blood and antigen mixing is very important Blood should be mixed properly! When harvesting, a small amount of haemolysis or RBCs is OK 487 mg/dL amount of haemoglobin has been shown to not affect the assay Other Interfering substances have also been examined and have been shown to have no affect: Bilirubin (19.7 mg/dL free & 21.8 mg/dL conjugated) QuantiFERON ® -TB Gold 3G

72 Sample & Assay Technologies Problem Solving ELISA Inadequate or incorrect washing is the most common cause of QFT ELISA error. Wash volumes should: Reach top of each well Positive meniscus (if possible) Blocked washer probes can be cleaned with a fine wire. Minimum of 6 complete washes are suggested as a minimum, however additional washes can be performed without affecting the performance of the assay. A soak period of at least 5 seconds between each cycle is recommended. QuantiFERON ® -TB Gold 3G

73 Sample & Assay Technologies Problem Solving QuantiFERON ® -TB Gold 3G ELISA - Non specific Colour Development Incomplete washing of plate Wells filled Blocked Probes Number of Cycles Soak Time Cross-contamination of ELISA wells Careful mixing Gently place plate down

74 Sample & Assay Technologies Problem Solving QuantiFERON ® -TB Gold 3G ELISA – High Background Incomplete washing of plate Conjugate reconstitution/dilution error Reconstitute with 300μL of water Dilute as per Table in Package Insert Incubation temperature too high Incubation should be at room temp ( ºC)

75 Sample & Assay Technologies Problem Solving QuantiFERON ® -TB Gold 3G ELISA – Low Absorbance Incubation temperature too low Incubation should be at room temp ( ºC) Incubation time too short Primary incubation 120 minutes Secondary Incubation 30 minutes Reagents cold Equilibrate for 1 hour Substrate mixed too vigorously Mixed by gentle inversion Incorrect filters in reader 450/ nm

76 Sample & Assay Technologies Problem Solving QuantiFERON ® -TB Gold 3G ELISA – Poor Standard Curve Incomplete washing of plate Standard dilution error Dilute as per Table in Package Insert S1 is neat standard Inconsistent pipetting technique Ensure pipettes set to correct volume Ensure no bubbles in pipette tips Avoid holding multichannel pipette on angle

77 Sample & Assay Technologies Results Interpretation High Nil results High circulating IFN-γ Contamination e.g. tubes, butterflies, syringes Repeat testing inconsistent –Close to cut-off? –ELISA technical issue Problem Solving

78 Sample & Assay Technologies Results Interpretation Mitogen off-scale (software reports > 10 UI/ml) Normal, no impact of outcome of test Low Mitogen –Patient population –Inadequate mixing –Inappropriate handling Incubated within >16 hours Not transported at room temperature Problem Solving


Pobierz ppt "Sample & Assay Technologies QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska."

Podobne prezentacje


Reklamy Google