Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Obrazowanie i analiza blastocyst bydlęcych - zastosowanie spektroskopii wibracyjnej (FTIR) Anna Wiecheć Zakład Spektroskopii Stosowanej Seminarium IFJ.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Obrazowanie i analiza blastocyst bydlęcych - zastosowanie spektroskopii wibracyjnej (FTIR) Anna Wiecheć Zakład Spektroskopii Stosowanej Seminarium IFJ."— Zapis prezentacji:

1 Obrazowanie i analiza blastocyst bydlęcych - zastosowanie spektroskopii wibracyjnej (FTIR) Anna Wiecheć Zakład Spektroskopii Stosowanej Seminarium IFJ

2 PLAN SEMINARIUM: Spektroskopia FTIR Co to są blastocysty Materiał badawczy – utrwalone blastocysty bydlęce Metoda badawcza – spektroskopia w podczerwieni z zastosowaniem źródła laboratoryjnego i detektora FPA Rezultaty – mapy 2D, analiza statystyczna (hierarchiczna analiza klastrowa z zastosowaniem metody Warda, analiza głównych składowych PCA, analiza wybranych pików) Podsumowanie

3 Spektroskopia wibracyjna w podczerwieni z zastosowaniem transformaty Fouriera (spektroskopia FTIR) Metoda polega na analizie pochłoniętego promieniowania elektromagnetycznego przez badaną substancję (drgające cząsteczki). Absorbancja A zależy od rodzaju promieniowania, stężenia substancji w próbce i długości drogi promieniowania w próbce. I=I cαd Prawo Lamberta-Beera: Natężenie światła padającego na próbkę maleje wykładniczo, ze wzrostem długości drogi tego promieniowania w próbce Acαdcαd I I 0 log d I – natężenie promieniowania po przejściu przez próbkę I 0 - natężenie promieniowania padającego na próbkę d – długość drogi promieniowania w próbce c - stężenie molowe substancji absorbującej α - molowy współczynnik absorpcji

4 Spektroskopia wibracyjna w podczerwieni z zastosowaniem transformaty Fouriera (spektroskopia FTIR) Idea pomiaru: Próbka badana Źródło promieniowania IR (polichromatyczne) Wzorzec Detektor, Obróbka sygnału, Transformację Fouriera widma interferencyjnego Interferencyjne widmo IR

5 Bliska podczerwień (NIR – near InfraRed) Średnia podczerwień (MIR – mid InfraRed) Daleka podczerwień (FIR – far InfraRed) Długość fali λ [μm] 0,8-2,52, Liczba falowa ν [1/cm]* * ν [1/cm]*= 1000/ λ [μm] ,01nm 1nm 100nm 400nm 800nm 1mm 1m - ( [cm -1 ]) analiza grup funkcyjnych biocząsteczek, -(700 – 1500[cm -1 ]) obszar daktyloskopowy – analiza biocząsteczek, Spektroskopia wibracyjna w podczerwieni z zastosowaniem transformaty Fouriera (spektroskopia FTIR) w których podczas wibracji zmienia się moment dipolowy - analiza drgań wiązań między atomami w cząsteczce (analiza widm oscylacyjnych)

6 Rodzaje drgań cząsteczkowych Drgania rozciągające Drgania deformacyjne W płaszczyźnie Kołyszące Nożycowe Poza płaszczyzną Wachlarzowe Skręcające Symetryczne Asymetryczne

7 Widmo charakterystyczne dla komórki: Literatura: Stuard,2004; Socrates Group, 2004 Lipidy (2850cm -1 – 3010cm -1 ) Symetryczne i asymetryczne rozciągania grup CH 3, CH 2, =C-H Cukry: 1155 cm -1, 1032 cm -1 – rozciąganie –C-O Białka: Amid Irz (1654 cm -1 ) 80% C=O rozciąganie, 10% C- N rozciąganie, 10% N-H rozciąganie Białka: Amid IIrz (1567cm -1 ) 60% N–H rozciąganie; 40% C–N rozciąganie Białka: Amid IIIrz (1299 cm -1 ) 30% C–N rozciaganie; 30% N–H zginanie; 10% C=O rozciąganie; 10% O=C–N zginanie; 20% inne Kwasy nukleinowe (950cm cm -1 ) 1244 cm -1 – asymetryczne rozciąganie PO 2 w RNA 1230 cm -1 – asymetryczne rozciąganie PO 2 w DNA 1089 cm -1 – symetryczne rozciąganie PO2 w DNA 1084 cm -1 – symetryczne rozciąganie PO2 w RNA

8 Blastocysta gr. blastós – kiełek, zarodek, kýstis – pęcherz - to stadium rozwojowe zarodka ssaków łożyskowych gotowe do zagnieżdżenia w macicy.

9 bioreview2.wikispaces.c om/Stages+of+Embryo (pierwotna jama ciała) (węzeł zarodkowy, embrioblast) Blastocysta - pierwsze stadium rozwojowe z wyróżnionymi częściami zarodka W warunkach in vitro na tym etapie bardzo często występuje zahamowanie rozwoju zarodka. Komórki macierzyste dla zarodka właściwego Komórki macierzyste dla łożyska

10 Dojrzałość oocytu (komórki jajowej) jest podstawowym warunkiem jego zdolności do zapłodnienia i prawidłowego rozwoju zarodkowego, a następnie płodowego. Podczas dojrzewania in vitro ponad 80% oocytów osiąga stadium metafazy II (MII) (osiąga dojrzałość mejotyczną). Z kolei, 7080% w pełni dojrzałych oocytów jest zdolnych do zapłodnienia. Z nich tylko 50% rozwija się do stadium blastocysty podczas hodowli in vitro [ Mermillod i in., 1999; Kątska-Książkiewicz i in., 2007]. Jednym z czynników ograniczających zdolności rozwojowe oocytów in vitro może być ich nieprawidłowe dojrzewanie, spowodowane suboptymalnymi warunkami hodowli [Moor i in., 1998]. Oocyt II rzędu (stadium MII) Oocyt I rzędu (stadium MI) stwy/dna/ha/oocyt-GV.html

11 Hialuronian (HA) – glikozoaminoglikan (polisacharyd): Nie tworzy kowalencyjnego wiązania z białkami, nie może więc wchodzić w skład typowego proteoglikanu. Może natomiast stanowić oś, na której wiążą się inne proteoglikany tworząc wraz z nimi "agregat proteoglikanu". Wchodzi w skład macierzy zewnątrzkomórkowej. Instytut Zootechniki w Balicach – prowadzi badania wpływu hialuronianu na kompetencje rozwojowe oocytów. Hialuronian jest produkowany w warunkach in vivo w komórkach sąsiadujących (komórki wzgórza jajonośnego) z oocytem. Na podstawie wstępnych badań [E.Latasiewicz, J.Opiela, Wiadomości Zootechniczne R. XLIX (2011) 4:3-7] : zaobserwowano wzrost liczby dojrzałych oocytów dla stężenie 0,07% HA nie zaobserwowano wpływu na wzrost fragmentacji DNA (HA nie przyspiesza apoptozy) [ Laurent T.C., J. R.E. Fraser (1992) The FASEB Journal vol. 6 no ]

12 Materiał badawczy Materiał badawczy dostarczony z Instytutu Zootechniki, Balice – dr inż. Jolanta Opiela Blastocysty bydlęce (utrwalone) Blastocysta uzyskana z zapłodnienia oocytu hodowanego bez HA; blastocysta hodowana w pożywce SOF2 Blastocysta uzyskana z zapłodnienia oocytu hodowanego bez HA; blastocysta hodowana we współhodowli z komórkami Vero w pożywce B2 Kontrola doświadczenia Materiał - cel badania Blastocysta, uzyskana z zapłodnienia oocytu hodowanego z dodatkiem hialuronianu HA (12,5 μl 1% HA / ml pożywki IVM) (V k = 0,007%)

13 Cel badań Określenie wpływu dodatku hialuronianu (HA) do pożywki do dojrzewania oocytów bydlęcych na ich kompetencje rozwojowe. Określenie wpływu dodatku hialuronianu (HA) do pożywki do dojrzewania oocytów bydlęcych na ich kompetencje rozwojowe. Odpowiedź na pytania: Odpowiedź na pytania: Czy zastosowanie laboratoryjnego źródła promieniowania IR i detektora FPA pozwoli na zobrazowanie i analizę komórek zarodkowych w stadium blastocysty? Czy zastosowanie laboratoryjnego źródła promieniowania IR i detektora FPA pozwoli na zobrazowanie i analizę komórek zarodkowych w stadium blastocysty? Czy metody spektroskopowe mogą stanowić uzupełnienie testów biochemicznych w badaniach zarodków? Czy metody spektroskopowe mogą stanowić uzupełnienie testów biochemicznych w badaniach zarodków?

14 Metoda i urządzenia pomiarowe Miejsce: laboratorium SISSI (Source for Imaging and Spectroscopic Studies in the Infrared) synchrotron ELETTRA, Triest, Włochy Data pomiaru: Źródło IR: Laboratoryjne Globar Interferometr - Bruker VERTEX70 Mikroskop Vis/IR- Hyperion 3000 Detektor: Focal Plane Array (FPA, 64 x 64 piksele) 15xobjektyw: 1 pixel= 2,65 μm Rozmiar obrazowanego obszaru próbki: 170 μm x 170 μm Zakres spektralny: 900 cm -1 – 4000 cm -1 Rozdzielczość spektralna: 4 cm -1 Liczba skanów: 64 SPEKTROSKOPIA W ZAKRESIE PODCZERWIENI Z ZASTOSOWANIEM TRANSFORMATY FOURIERA

15 Blastocysta kontrolna (K) Blastocysta ze współhodowli kontrolna (KV) Blastocysta (H) Dwuwymiarowe mapy rozkładu intensywności wybranych pasm absorpcji: DNA (1250cm cm -1 ) Amidy I i II rz (1715cm cm -1 )

16 Blastocysta kontrolna (K) Blastocysta ze współhodowli Vero kontrolna (KV) Blastocysta (H) Lipidy (3020cm cm -1 ) Białka, lipidy (1400cm cm -1 ) Dwuwymiarowe mapy rozkładu inte n sywności wybranych pasm absorpcji:

17 Dla każdej blastocysty wyekstrahowano po 40 widm komórek z rejonu węzła zarodkowego Analizowany zakres widma: 900cm -1 – 1850cm -1 Wykonano korektę ze względu na rozpraszanie fali elektromagnetycznej na przedmiotach sferycznych o wielkości porównywalnej do długości fali (Mie scattering, P. Bassan, University of Manchester, UK) Przeprowadzono normalizację wektorową. Analiza danych

18 Zastosowane metody wielowymiarowej analizy wariancji: 1.Hierarchiczna analiza klastrowa: - optymalne grupowanie obserwacji (obiekty podobne znajdują się w obrębie jednego klastra) -metoda Warda: analiza wariancji; zmierza do minimalizacji sumy kwadratów odchyleń dwóch dowolnych skupień -Miarą odległości lub rozbieżności między obiektami jest odległość euklidesowa = rzeczywista odległość geometryczna między obserwacjami w przypadku dwóch lub trzech wymiarów

19 Hierarchiczna analiza klastrowa z zastosowaniem metody Warda (dendrodiagram) K - kontrola (40 widm) KV – kontrola +Vero (40 widm) H – blastocysta (40widm) Numery widm komórek badanych blastocyst Odległość wiązania [a.u.] Diagram drzewa Metoda Warda Odl euklidesowa

20 Analiza składowych głównych (ang. Principal Component Analysis, PCA): - PCA pozwala na wizualizację danych oraz analizę wielowymiarowych danych poprzez ich kompresję - zredukowanie liczby czynników losowych; zmienne losowe w danej grupie stają się od siebie zależne - wykrywanie struktury w związkach między zmiennymi - klasyfikacja zmiennych poprzez znalezienie składowych głównych (PC), które opisują wariancję; - Określenie zależność między głównymi składowymi a danymi na podstawie analizy ładunków czynnikowych Zastosowane metody wielowymiarowej analizy wariancji:

21 Analiza składowych głównych (ang. Principal Component Analysis, PCA ) Projekcja próbek na przestrzeń zdefiniowaną przez trzy czynniki główne (obok czynników głównych podano procent opisanej wariancji danych przez każdy czynnik)

22 Wartości ładunków czynnikowych [j.u.] Liczba falowa [1/cm] (92,7%) (5,8%) (1,2%) Ładunki czynnikowe to korelacje między zmiennymi a czynnikami PC Analiza składowych głównych (ang. Principal Component Analysis, PCA ) Amid IIIrz Amid IIrz Amid Irz

23 Analiza pików charakterystycznych dla biomolekuł: Amid IIrz (1462 rozciąganie C-N, 1544 zaginanie wiazania N-H) Średnie widma komórek blastocyst Amid Irz (1654) 80% C=O rozciąganie, 10% C- N rozciąganie, 10% N-H rozciąganie Lipidy, Amidy IIIrz (1357) asymetryczne i symetryczne, nożycowe drgania w C-H w wiązaniu CH 3 Rejon DNA ( ) Literatura: Stuard,2004; Socrates Group, 2004

24 Analiza pików charakterystycznych dla biomolekuł Pola powierzchni pod pikami [j.u.] Intensywność pików świadczy o ilościowej zawartości biokomponentów w komórkach blastocyst Amid IIIrz, lipidy, (1357cm -1 ) ±SD Amid IIrz (1462cm -1 ) ±SD Amid IIrz (1544cm -1 ) ±SD Amid Irz (1654cm -1 ) ±SD Suma pól pod pikami ±SD Suma pól pod pikami (bez Amidu IIrz) ±SD Kontrola 10 x ±0,5 x x ,4 x x ,8 x x ,5 x x ,4 x x ,4 x blastoHA 16 x ,2 x x ,5 x x ,7 x x ,0 x x ,2 x x ,1 x Blasto+ Vero 18 x ,7 x x ,7 x x ,4 x x ,6 x x ,1 x x ,0 x Kompetencje rozwojowe oocytu są zależne od jakościowego i ilościowego składu cytoplazmy.

25 Analiza pasm charakterystycznych dla biomolekuł: α helisa β struktura = A(1654cm -1) A(1635cm -1) Analiza struktury drugorzędowej białek (jakościowa analiza, pozwala wnioskować o zmianach konformacyjnych w białkach): Kontrola = 1,23 Blasto (HA) = 1,04 Blasto +Vero= 1,11 Analiza stosunku kwasów nukleinowych (określenie intensywności procesów replikacji DNA czy transkrypcji RNA) : RNA (uracyl) DNA (asymetryczne rozc PO 2- ) = A(996cm -1 ) A(1230cm -1 ) Kontrola = 0,56 Blasto (HA) = 0,35 Blasto +Vero= 0,26

26 Podsumowanie Zastosowanie źródła laboratoryjnego IR i detektora FPA pozwala obrazować pasma charakterystyczne dla danej biomolekuły (np. DNA, białek) obecnej w komórkach blastocyst bydlęcych. Zastosowanie źródła laboratoryjnego IR i detektora FPA pozwala obrazować pasma charakterystyczne dla danej biomolekuły (np. DNA, białek) obecnej w komórkach blastocyst bydlęcych. Na tej podstawie można wnioskować jaki jest rozkład danej biomolekuły np. intensywność pasma DNA - gdzie jest najwięcej komórek lub jaki jest rozkład materiału zapasowego – lipidy, białka. Możliwe jest wyekstrahowanie widm pojedynczych komórek i przeprowadzenie analizy m.in. statystycznej w celu zbadania czy istnieją różnice pomiędzy komórkami w badanych blastocystach. Na podstawie hierarchicznej analizy klastrowej oraz analizy składowych głównych (PCA) można wnioskować, że komórki blastocysty, której oocyt był hodowany w pożywce z hialuronianem są bardziej podobne do komórek blastocysty pochodzącej ze współhodowli Vero niż do komórek blastocysty kontrolnej. Na podstawie hierarchicznej analizy klastrowej oraz analizy składowych głównych (PCA) można wnioskować, że komórki blastocysty, której oocyt był hodowany w pożywce z hialuronianem są bardziej podobne do komórek blastocysty pochodzącej ze współhodowli Vero niż do komórek blastocysty kontrolnej.

27 Na podstawie analizy pól powierzchni pod pikami możliwe jest przeprowadzenie ilościowej analizy głównych biomolekuł. Na podstawie analizy pól powierzchni pod pikami możliwe jest przeprowadzenie ilościowej analizy głównych biomolekuł. Komórki blastocysty hodowanej we współhodowli Vero posiadają ilościowo największe zasoby biomolekuł, głównie Amidu IIrz. Jeśli wykluczymy Amidy IIrz, wówczas komórki blastocysty, której oocyt był hodowany w pożywce z hialuronianem posiadają podobne ilości biomolekuł w porównaniu do blastocyst hodowanych we współhodowli Vero oraz jednocześnie mniejsze zasoby biomolekuł w porównaniu do komórek blastocysty kontrolnej. Komórki blastocysty hodowanej we współhodowli Vero posiadają ilościowo największe zasoby biomolekuł, głównie Amidu IIrz. Jeśli wykluczymy Amidy IIrz, wówczas komórki blastocysty, której oocyt był hodowany w pożywce z hialuronianem posiadają podobne ilości biomolekuł w porównaniu do blastocyst hodowanych we współhodowli Vero oraz jednocześnie mniejsze zasoby biomolekuł w porównaniu do komórek blastocysty kontrolnej. Podsumowanie Określenie drugorzędowej struktury białek pozwala wnioskować o zmianach konformacyjnych w białkach, co może mieć znaczenie w badaniu rozwoju blastocyst. Określenie drugorzędowej struktury białek pozwala wnioskować o zmianach konformacyjnych w białkach, co może mieć znaczenie w badaniu rozwoju blastocyst. Stosunek α helisy do β struktury jest porównywalny dla wszystkich komórek blastocyst. Analiza ilościowa kwasów nukleinowych pozwala określić intensywność procesów replikacji DNA czy transkrypcji RNA, co może mieć znaczenie w procesach dojrzewania oocytów. Analiza ilościowa kwasów nukleinowych pozwala określić intensywność procesów replikacji DNA czy transkrypcji RNA, co może mieć znaczenie w procesach dojrzewania oocytów. Wartości stosunków RNA/DNA są porównywalne, co może świadczyć o tym, że intersywne procesy transkrypcji nie rozpoczęły się jeszcze, komórki blastocyst korzystają z substancji odziedziczonych od oocytów. Wartości stosunków RNA/DNA są porównywalne, co może świadczyć o tym, że intersywne procesy transkrypcji nie rozpoczęły się jeszcze, komórki blastocyst korzystają z substancji odziedziczonych od oocytów.

28 Podsumowanie W celu wyciągnięcia ostatecznych wniosków na temat wpływu hialuronianu na kompetencje rozwojo w e ooc y tów potrzebne są dalsze badania oraz korelacja danych uzyskanych metodą spektroskopii FTIR z danymi uzyskanymi metodami biochemicznymi.

29 Podziękowania Dr inż. Jolanta Opiela – Instytut Zootechniki, Balice Mgr inż. Ewelina Lipiec – IFJ PAN, Kraków Dr Lisa Vaccari Dr Giovani Birarda Synchrotron ELLETRA, Triest

30 Dziękuję Państwu za uwagę


Pobierz ppt "Obrazowanie i analiza blastocyst bydlęcych - zastosowanie spektroskopii wibracyjnej (FTIR) Anna Wiecheć Zakład Spektroskopii Stosowanej Seminarium IFJ."

Podobne prezentacje


Reklamy Google