PRZEPROWADZONE BADANIA

Prezentacja na temat: "PRZEPROWADZONE BADANIA"— Zapis prezentacji:

1 PRZEPROWADZONE BADANIA
L-dopa jest to bardzo ważny naturalny aminokwas endogenny. Jest prekursorem w syntezie melanin, które są pigmentem występującym głównie w skórze właściwej i naskórku, a także w tęczówce, nadając jej zależnie od rozmieszczenia barwnika charakterystyczny kolor. L-dopa jest również prekursorem w syntezie amin katecholowych tj. dopaminy, noradrenaliny oraz adrenaliny. Znajduje ona także zastosowanie w farmakologii jako lek łagodzący skutki choroby Parkinsona. WŁAŚCIWOŚCI L-DOPY L - DOPA 3‘, 4'- dihydroksy-L-fenyloalanina Biały proszek słabo rozpuszczalny w wodzie, nierozpuszczalny w etanolu Temperatura topnienia 285ºC Stabilna przy pH 5,5-7,0 Do syntezy związków znakowanych wykorzystałam dwa enzymy: apotryptofanazę (EC ) należącą do klasy liaz oraz tyrozynazę (EC ) należącą do klasy oksyreduktaz. - Monooksygenaza monofenolowa lub polifenoloksydaza - Masa cząsteczkowa tyrozynazy wyizolowanej z Neurospora Crassa Daltonów - 407 aminokwasów Centrum aktywne zawiera diamagnetyczny kompleks miedzi (II) - Maksymalna aktywność: - T ºC - pH 5,5 -7 - Rodzaje aktywności - krezolazowa hydroksyluje monofenole do o-difenoli - katecholazowa utlenia o–difenole do o-chinonów Inhibitory: - azydki, cyjanki, fenylomocznik, dietyloditiokarbamid, 2-merkaptoetanol, cysteina. Jest silnie hamowana przez substancje organiczne np. kwas benzoesowy i nieodwracalnie dezaktywowana w obecności substancji katecholowych. TYROZYNAZA EC Celem mojej pracy magisterskiej było: Opracowanie metody syntezy, identyfikacji, wydzielenia i oczyszczenia L-tyrozyny i L-dopy znakowanych izotopami wodoru. Przeprowadzenie syntez: L-dopy [-2H]-L-dopy [-3H]-L-tyrozyny [-3H]-L-dopy [-2H/3H]-L-tyrozyny [-2H/3H]-L-dopy ENZYMATYCZNA SYNTEZA L-DOPY ZNAKOWANEJ IZOTOPAMI WODORU W POZYCJI α. Izabela Dąbrowska Praca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego Promotor pracy: prof. dr hab. Marianna Kańska Opiekun pracy: mgr Małgorzata Pająk APOTRYPTOFANAZA EC TYROZYNAZA EC SYNTEZY [α-X]-L-DOPY PRZEPROWADZONE BADANIA Przed przystąpieniem do syntez radioaktywnych przeprowadziłam serię eksperymentów ze związkami nieaktywnymi w celu ustalenia optymalnych warunków rozdziału, identyfikacji oraz oczyszczenia [-X]-L-tyrozyny i [-X]-L-dopy. [-2H/3H]-L-TYROZYNA gdzie X = 2H, 3H, 2H/3H SYNTEZY [-X]-L-TYROZYNY [-3H]-L-TYROZYNA Miejsce i stopień inkorporacji deuteru do cząsteczki [-X]-L-tyrozyny potwierdzano przy pomocy widm protonowego rezonansu jądrowego. gdzie X= H, 2H, 3H, 2H/3H LITERATURA R. Murray Biochemia Harpera 1998 HS. Pomerantz Biochemical and Biophysical Research Communications 1964, 16, HS. Pomerantz The Journal or Biological chemistry 1963, 238, VJ. Hearing, TM. Ekel The Biochemical Journal 1976, JR Ros, JN. Rodriguez-Lopez, F. Garcia-Canovas The Biochemical journal 1993, 295, J. Haavik Journal Neurochemistry 1997, 69, K. Lerch The Proceedings of the National Academy of Sciencess of the USA 1978, 75, C. Chintamaneni, A.R.Nadimpali Indian journal of biochemistry and biophysics 1991, 28, 408 – 411 C.Daglish The Biochemical journal 1951, 49, PODSUMOWANIE Cele jakie postawiłam sobie na początku realizowania mojej pracy zostały przeze mnie osiągnięte. Otrzymałam następujące związki: [-2H]-L-dopę, [-3H]-L-tyrozynę, [-3H]-L-dopę, [-2H/3H]-L-tyrozynę, [-2H/3H]-L-dopę. Związki otrzymane przeze mnie zostaną wykorzystane do badania mechanizmu reakcji tworzenia dopaminy metodą kinetycznych efektów izotopowych. Obecność [α-X]-L-dopy mogłam potwierdzić za pomocą chromatografii cienkowarstwowej wykorzystując płytki pokryte tlenkiem glinu. Płytki rozwijałam w układzie C4H9OH : CH3COOH : H2O (4:1:2) (v/v), a wywoływałam alkoholowym roztworem ninhydryny. Dodatkowo obecność [α-X]-L-dopy sprawdzałam dodając KIO3. Reakcja zachodzi w temperaturze pokojowej. W wyniku tej reakcji powstaje 1,2-dopachinon. W trakcie tworzenia się chinonu następowała zmiana zabarwienia roztworu z bezbarwnego na pomarańczowy. Do rozdziału [-X]-L-tyrozyny i [-X]-L-dopy wybrałam chromatografię kolumnową. Wypełnieniem był tlenek glinu zawieszony w octanie amonu. Tyrozynę wymywałam octanem amonu, a [-X]-L-dopę kwasem solnym. Oczyszczanie [-X]-L-dopy przeprowadziłam na kolumnie wypełnionej tlenkiem glinu zawieszonym w wodzie. [-X]-L-dopę wymywałam kwasem solnym. W przypadku syntez [-X]-L-dopy znakowanej trytem oraz deuterem i trytem jednocześnie przeprowadziłam badania radiochemiczne. Poniżej przedstawione są radiochromatogramy. [-2H/3H]-L-DOPA [-2H/3H]-L-TYROZYNA [-3H]-L-TYROZYNA [-3H]-L-DOPA Do identyfikacji [-X]-L-tyrozyny wykorzystałam chromatografię cienkowarstwową. W tym celu użyłam płytek pokrytych żelem krzemionkowym, które rozwijałam w układzie CH3CN : H2O (4:1) (v/v). Wizualizacji dokonywałam przy pomocy roztworu ninhydryny. Oczyszczanie [-X]-L-tyrozyny przeprowadziłam na kolumnie wypełnionej Amberlitem IR 120 H+ zawieszonym w wodzie i aktywowanym kwasem solnym. Tyrozynę wymywałam amoniakiem. W przypadku syntez radioaktywnych przeprowadziłam badania radiochemiczne. Poniżej przedstawione są radiochromatogramy.