OD POMYSŁU DO ZASTOSOWANIA CHIPY BIAŁKOWE OD POMYSŁU DO ZASTOSOWANIA Na podstawie pracy: ‘Protein chips: from concept to practice’ Young-Sam Lee i Milan Mrksich Jakub Gruszczyk Anna Piłat

Co to są chipy ? Inaczej mikromacierze, czujniki, znaczniki Mogą być zarówno DNA jak i białkowe Wyniki badań przeprowadzone przy ich użyciu można przedstawić wzorami złożonymi z różnobarwnych kropek Po raz pierwszy zostały wprowadzone na rynek w 1996 (mikromacierze DNA) Pozwalają na szybką, łatwą i równoczesną analizę tysiąca elementów w pojedynczym eksperymencie Są stosowane do analizy oddziaływań (antygen-przeciwciało, białko-białko, białko-kw.nukleinowy, białko-lipid, enzym-substrat)

Przykłady zastosowań chipów białkowych Niesłychanie przydatne w badaniu biologii komórki, mechanizmy badania nowotworów a także odkrycie molekularnych przyczyn wielu złożonych chorób, szybka diagnoza chorób i prognozowanie ich przebiegu, testowanie leków, podstawowe narzędzia do stworzenia nowych lekarstw, możliwość dostosowania terapii do indywidualnych potrzeb pacjenta, określanie typów białek oraz mierzenia ich ilości w tkankach.

Immobilizacja białek Reakcja grupy aminowej lizyny z zmodyfikowaną grupą aldehydową (znalazły zastosowanie w charakterystyce oddziaływań białko-białko a także badaniach produktów pośrednich powstałych w wyniku fosforylacji przez odpowiednie kinazy), inny przykład zastosowania: do indentyfikacji nowych klas kalmodulin i fosfolipidów wiążących białka, białka znakowane His-tag (łatwiejsze oczyszczanie).

Białkowe chipy używane do analizy aktywności białek drożdży Kilka tysięcy białek fuzyjnych z GST unieruchomionych na płytce Związanie przeciwciał anty-GST Identyfikacja białek wiążących kalmodulinę i fosfatydyloinozytole

Konstrukcja macierzy przeciwciał Immobilizacja bibliotek fagowych prezentujących fragment scFv przeciwciała na papierowym filtrze w celu selekcji przeciwciał względem specyficznych antygenów, stworzenie molekularnie zdefiniowanych macierzy, badanie reakcji przeciwciała z pokrewnymi antygenami, zastosowanie w medycynie macierzy przeciwciał rozpoznających 75 różnych cytokin; detekcja ilości femtomolowych.

Problemy związane z białkowymi chipami Niektóre interakcje zdefiniowane innymi metodami nie zostały potwierdzone. Przyczyną mogą być : brak jednolitości w aktywności immobilizowanych białek, immobilizacja białek w różnej konformacji, częściowa denaturacja białek na powierzchni, niespecyficzna adsorpcja białek do chipów (blokowanie na powierzchni z BSA, niekontrolowana adsorpcja białek z roztworu).

Zastosowanie do immobilizacji dobrze zdefiniowanych powierzchni Oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami zależy od wpływu otoczenia, nieznaczne zmiany w środowisku mają wpływ na zachowanie aktywności, istnieje zatem konieczność ujednolicenia warunków, w jakich znajdują się poszczególne immobilizowane cząsteczki.

Rozwinięcie strategii immobilizacji Kontrola przywarcia, gęstość ligandu, wiązanie białka do substratu (ocena aktywności immobilizowanych białek-region aktywny może być związany z sąsiednim białkiem lub powierzchnią macierzy i poprzez to może być zahamowana jego aktywność), His-tag może wiązać się do szklanej powierzchni prezentującej odpowiednią grupę chelatową.

Użycie biernych chemicznie i fizycznie powierzchni Powierzchnia bierna zapobiega zarówno niespecyficznej adsorpcji jak i denaturacji immbilizowanych białek, idealne podłoże do przygotowania chipów białkowych, wypierają one stopniowo stosowane dotychczas metody polegające na: blokowaniu powierzchni przy pomocy BSA, co może prowadzić do niespecyficznych oddziaływań, przeprowadzaniu eksperymentu w obecności detergentu, co może przeszkadzać w oddziaływaniach.

DETEKCJA Użyteczność każdego rodzaju mikromacierzy zależy od tego, jaka technika zostanie zastosowana do jej analizy. Zazwyczaj stosuje się detekcję opartą na fluorescencji lub zastosowaniu sond radioaktywnych w celu określenia związania się białek lub przeciwciał do macierzy.

DETEKCJA Sposoby detekcji ilości wiążącego się białka: Znakowanie białka sondą a następnie inkubacja na macierzy ; po odmyciu macierz jest analizowana w celu wykrycia obecności znakowanego białka i określenia typu związanego partnera, w celu identyfikacji określonej aktywności enzymatycznej, np. oznaczenie aktywności kinazowej polega na zastosowaniu przeciwciał przeciwko fosfotyrozynie, co pozwala na identyfikację substratów tych enzymów.

PORÓWNANIE METOD DETEKCJI analiza ilościowa real-time nieznakowane białka i złożone próbki nowe aktywności dostępność fluorescencja + - WYSOKA izotopy promieniotwórcze MALDI-TOF CZĘŚCIOWA POŚREDNIA SPR OGRANICZONA

DETEKCJA Chociaż zastosowanie znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych odznacza się wysoką czułością i rozdzielczością posiada jednak pewne ograniczenia: modyfikacja białka przy pomocy sondy ma wpływ na jego aktywność, koszt i utylizacja szczególnie w przypadku radioizotopów, ograniczenie do badania tylko tych oddziaływań, dla których cząsteczki zostały wyznakowane, a nie pozwala na odkrywanie nowych właściwości.

DETEKCJA Przykład dwóch technik nie wymagających znakowania białek i pozwalających na analizę skomplikowanych próbek o złożonym i często niezdefiniowanym składzie: SPR MALDI-TOF

MALDI-TOF MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (źródło jonów) Time Of Flight (analizator) jest jedną z technik spektrometrii masowej, wykorzystuje ona impuls laserowy w celu jonizacji próbki, energia lasera przekazywana jest matrycy zmieszanej z badaną próbką i przenoszona na analizowaną substancję, najczęściej stosowane matryce: kwas sinapinowy, kwas a-cyjanohydroksycynamonowy (aCHCA), kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB).

MALDI-TOF W wyniku uderzenia laserem próbka ulega jonizacji, co jest warunkiem jej przyśpieszenia w polu elektrycznym, jony analizowane są za pomocą detektora czasu przelotu, w którym jony cięższe docierają do detektora wolniej niż jony lżejsze, wynikiem analizy jest zawsze wartość m/z.

MALDI-TOF

MALDI-TOF Widmo MALDI TOF mioglobiny końskiej (po lewej) i jej mapy peptydowej powstałej w wyniku trawienia trypsyną (po prawej).

MALDI-TOF Zalety techniki: możliwość analizowania substancji o masach nawet do miliona [Da], dodatek nadmiaru matrycy w stosunku do analitu ogranicza powstawanie agregatów i ułatwia formowanie jonów molekularnych, nie ma potrzeby dostrajania długości fali lasera do częstotliwości absorpcji analizowanych próbek, desorpcja związku zachodzi w łagodnych warunkach, zatem można badać enzymatyczne modyfikacje różnych białek, umożliwia identyfikację białek związanych do macierzy poprzez potraktowanie enzymami proteolitycznymi a następnie analizie otrzymanych peptydów.

Surface Plasmon Resonance (SPR) Surface Plasmon Resonance (SPR) jest techniką, która pozwala na badanie w czasie rzeczywistym oddziaływań międzycząsteczkowych, wiązanie i dysocjacja są mierzone w jednostkach względnych a wyniki są przedstawiane w formie wykresu nazywanego sensorgramem, możliwa jest analiza nie tylko oddziaływań białko-białko, ale także: DNA-DNA, DNA-białko, lipid-białko, itp. Analiza oddziaływań pozwala na określenie: ile cząsteczek bierze udział w oddziaływaniu, siły tego oddziaływania, stałych szybkości asocjacji i dysocjacji. Ponadto możliwa jest analiza ilościowa po wykreśleniu krzywej kalibracyjnej.

SPR Główne zalety techniki: możliwość zastosowania nieznakowanych cząsteczek, możliwość pracy in situ, reagenty po związaniu nie musza być przepłukiwane i suszone przed analizą; ma to szczególne znaczenie do badań oddziaływań o niskim powinowactwie a zatem stabilności.

SPR zasada pomiaru Jedna z oddziałujących cząsteczek unieruchomiona zostaje na specjalnym szkle pokrytym warstewką złota, które stanowi jedną ze ścianek cienkiej komórki przepływowej, druga cząsteczka podawana jest w formie rozpuszczonej w odpowiednim buforze i przepływa wraz ze strumieniem cieczy nad powierzchnią złota, światło z zakresu VIS lub IR pada poprzez pryzmat i szklaną płytkę na warstewkę złota, w zależności od otoczenia atomy złota mają różną zdolność do odbijania światła a przez to są bardzo czułe na zmiany zachodzące w ich pobliżu, wynikające na przykład ze związania innej cząsteczki, czułość reakcji atomów złota związana jest z bardzo wydajnym wzbudzeniem elektronów przewodzenia na powierzchni warstewki złota.

SPR http://home.hccnet.nl/ja.marquart/Sensorchips

SPR

PODSUMOWANIE                                                        Chipy białkowe mogą dostarczyć wielu interesujących informacji na temat oddziaływań pomiędzy biocząsteczkami, mają one ogromną szansę stać się powszechnym narzędziem także w diagnostyce, rozwój w tej dziedzinie skorelowany jest z rozwojem różnorodnych technik immobilizacji białek, metody, takie jak MALDI-TOF czy SPR, stanowią konkurencyjne i pełne nowych możliwości sposoby analizy chipów białkowych.

LITERATURA ‘Protein chips: from concept to practice’ Young-Sam Lee, Milan Mrksich TRENDS in Biotechnology Vol. 20 No. 12, 2002 Adam Dubin, Wprowadzenie do chemii białek, Kraków 2003 http://www.chemia.uj.edu.pl/slafibs/ms_opis.htm http://home.hccnet.nl/ja.marquart/Sensorchips http://home.hccnet.nl

DZIĘKUJEMY ZA UWAGĘ 