LEUKOCYTY – KRWINKI BIAŁE – WBC Wartości prawidłowe – dorośli 4,0 – 10,0 x 103/ ul (x 106/l) LEUKOCYTOZA - WBC 10,0 x 103/ ul fizjologiczny (ze wzrostem % neutrofili) ciąża, poród, stres (neutrofilia krzyku u maluchów), posiłek, wysiłek fizyczny wiek (noworodki, od 6 r.ż.)   patologiczny ostre i przewlekłe procesy zapalne zakażenia : bakteryjne (posocznice, ropnie), wirusowe (półpasiec), pasożytnicze, grzybicze nowotwory zwłaszcza z obecnością przerzutów ch. rozrostowe układu krwiotwórczego: P.B.SZ., ziarnica złośliwa, czerwienica ostre krwotoki uszkodzenie tkanek : oparzenia, rozległe urazy, stany pooperacyjne, zawał m. sercowego, ostra martwica wątroby zaburzenia metaboliczne : mocznica, kwasica cukrzycowa, rzucawka ciężarnych, ostry napad dny moczanowej

LEUKOPENIA - WBC 4,0 x 103/ul   aplazja szpiku hipoplazja szpiku wrodzona i nabyta uszkodzenie szpiku pod wpływem leków : -p. padaczkowe, p. gruźlicze, chloramfenikol, p. zapalne, doustne p. cukrzycowe, leki stosowane w nadczynności tarczycy ciężkie zakażenia bakteryjne: posocznice G-, bakteryjne zapalenie wsierdzia, gruźlica prosówkowa, dury, paradury zakażenia wirusowe: grypa, odra, WZW, ospa wietrzna, różyczka wstrząs anafilaktyczny kolagenozy zespoły rozrostowe (ALL, szpiczak) MDS hipersplenizm

2,5 – 5,0 x 103/ul NEUTROCYTY Wartości prawidłowe – 45 – 70 % dorośli NEUTROCYTOZA = NEUTROFILIA - bezwzględnej liczby N powyżej 5,5 x 103/ul Stan fizjologiczny noworodki i niemowlęta II połowa ciąży, poród, połóg wysiłek fizyczny stres, silny ból odczynowe Stan patologiczny - przesunięcie w lewo ( P i metamielocyty) (odmłodzenie) rozrostowe Odczynowe ostre stany zapalne ostre zakażenia bakteryjne oparzenia martwicze uszkodzenie tkanek rozległe urazy (przez 1-2 dni po zabiegach operacyjnych) po ostrym krwotoku ( po 1-2 h) zatrucia endo- i egzogenne

Przesunięcie w prawo Przesunięcie w lewo rozrostowe zespoły mieloproliferacyjne ziarnica złośliwa Przerwa białaczkowa - Hiatus leucaemicus - występowanie we krwi form blastycznych oraz zwiększonego odsetka neutrocytów bez form pośrednich linii mieloidalnej. - występuje w ostrych białaczkach Noworodki - dominacja N I skrzyżowanie - ok. 6 dnia życia - N L (kształtowanie odporności) II skrzyżowanie - ok. 6 roku życia - L N Przesunięcie w prawo obecność we krwi neutrocytów o jądrze ze zwiększoną liczbą segmentów (7-8) np. ch. Addisona-Biermera

NEUTROPENIA liczby N poniżej 1,5 x 103/ul (dorośli i dzieci) ch. zakaźne – dur brzuszny, bruceloza - ch. wirusowe: odra, różyczka, WZW kolagenozy wstrząs anafilaktyczny działanie promieni jonizujących działanie związków chemicznych (benzen) działanie leków (chloramfenikol, piramidon) niektóre zespoły hemolityczne: ch. A-B, aplazja szpiku AGRANULOCYTOZA liczby N poniżej 0,5 x 103/ul (dorośli i dzieci) lub całkowity zanik Przyczyny: nadwrażliwość osobnicza na leki, substancje chemiczne (wytwarzanie p/c przeciwko własnym leukocytom): obraz układu czerwonokrwinkowego - norma dominacja limfocytów w rozmazie - 80 - 90 % wzrost % monocytów rokowanie pomyślne brak wzrostu złe rokowanie zahamowanie dojrzewania granulocytów nadczynność układu siateczkowo-śródbłonkowego

ANOMALIE JAKOŚCIOWE NEUTROCYTÓW anomalia wrodzona Pelgera i Huëta - niepełna segmentacja neutrocytów (2), ale bez zaburzenia ich czynności - występuje u ok. 1 % ludzi , bez znaczenia klinicznego anomalia nabyta pseudopelgerowska - występuje w przebiegu choroby np.: ostre białaczki, MDS, aplazja szpiku hipersegmentacja jąder neutrocytów obojętnochłonnych - przesunięcie w prawo, wzrost liczby segmentów (5-7) - występuje w chorobie Addisona- Biermera ziarnistości toksyczne - grube azurochłonne, ciemnofioletowe ziarnistości w cytoplaźmie neutrocytów (pozostałość ziarnistości promielocytów- zaburzone dojrzewanie N) - występują w przebiegu: ciężkie procesy zapalne i toksyczne nowotwory z przerzutami, odczyny białaczkowe pałeczki Auera - czerwono -fioletowe kreseczki w mieloblastach lub promielocytach MPO+, - swoisty objaw AML

wodniczki w cytoplaźmie - okrągłe puste przestrzenie w cytoplaźmie - występują w : anomalia Jordansa - wodniczki lipidowe w N i M ciężkie stany zapalne (posocznica) ciężkie zatrucia grzybami ciężkie choroby wątroby (marskość, ostry żółty zanik wątroby) ciałka Doehlego - ogniska bezziarnistej cytoplazmy zabarwionej na niebiesko (okrągłe lub wrzecionowate) - pozostałość mRNA w następstwie zaburzeń dojrzewania cytoplazmy - występuje w : anomalia wrodzona Maya i Hegglina zespół Chediaka - ciężko przebiegające infekcje związane z zaburzeniami funkcji N ( zmniejszona zdolność bakteriobójcza niezależna od tlenu oraz zaburzona chemotaksja) - zwiększona skłonność do występowania chłoniaków + bielactwo skóry (białe włosy, bezbarwne tęczówki) zespół Aldera - Reilly’ego = mukopolisacharydoza = maszkaronizm - spichrzanie wielocukrów w różnych tkankach, szczególnie w kościach

choroby skóry - świerzb kolagenozy EOZYNOFILE wartości prawidłowe: 2 - 4 % 40 - 400/ ul wahania fizjologiczne : min - rano i popołudnie min - przed owulacją max - noc max - po owulacji EOZYNOFILIA - liczby eozynofili ponad 400/ ul alergie: choroby pasożytnicze : - dychawica oskrzelowa - włośnica - pokrzywka uczuleniowa - toksoplazmoza - choroba posurowicza - glistnica, owsica - katar sienny - lamblioza choroby skóry - świerzb kolagenozy - łuszczyca choroby zakaźne np. płonica - pęcherzyca ch. rozrostowe - PBSZ inne choroby: - chłoniak skóry - ziarnica złośliwa - przewlekłe zap. wątroby - czerwienica prawdziwa

bezwzglednej liczby eozynofili poniżej 40/ ul Stan fizjologiczny EOZYNOPENIA bezwzglednej liczby eozynofili poniżej 40/ ul Stan fizjologiczny po wysiłku fizycznym ciąża i okres okołoporodowy Stan patologiczny po urazach po zabiegach operacyjnych leczenie GKK np. Encorton ch. endokrynne związane ze zwiększonym wydzielaniem GKK posocznica dur brzuszny

LIMFOCYTOZA - powyżej 4 x 103 /ul dorośli LIMFOCYTY norma - 20 - 45 % 1,5 - 4,0 x 103 /ul LIMFOCYTOZA - powyżej 4 x 103 /ul dorośli 7 x 103 /ul dzieci 9 x 103 /ul niemowlaki Stan fizjologiczny: niemowlęta i dzieci do 6 r.ż. Stany patologiczne: przewaga limfocytów dojrzałych: - CLL - nadczynność tarczycy przewaga limfocytów atypowych = aktywowanych: infekcje wirusowe: - mononukleoza zakaźna - wirusowe zapalenie wątroby - nagminne zapalenie ślinianek przyusznych - półpasiec - odra - różyczka - wirusowe zapalenie płuc

LIMFOPENIA PLAZMOCYTY liczby limfocytów poniżej 1000 / ul - dorośli 2000/ ul - dzieci Stan fizjologiczny: - ciąża, stres, wysiłek fizyczny Stan patologiczny: - ch. rozrostowe: ostra i przewlekła białaczka szpikowa chłoniak złośliwy - AIDS - ostre zapalenie trzustki - radioterapia - kortykoterapia PLAZMOCYTY - mononukleoza zakaźna - różyczka - plazmocytoma - szpiczak mnogi - siatkowiak plazmocytowy

liczby monocytów powyżej 800 /ul - dorośli MONOCYTY norma 3 - 8 % 200 - 800 /ul MONOCYTOZA liczby monocytów powyżej 800 /ul - dorośli 1000/ul - dzieci 3000/ul - niemowlęta choroby zakaźne: gruźlica mononukleoza zakaźna nagminne zapalenie ślinianek przyusznych wirusowe zapalenie wątroby, wirusowe zapalenie płuc ospa wietrzna, bruceloza, kiła choroby hematologiczne: białaczka monocytowa (AML 5) ch. Hodgkina inne choroby: marskość wątroby, RKZ, kolagenozy stany pozapalne : tzw. faza przesilenia ( M ), faza zdrowienia -( L ) MONOCYTOPENIA - 200/ ul kortykosteroidy

BAZOFILE norma - 0 - 1 % 20 - 100 / ul BAZOFILIA - powyżej 100/ul przewlekłe zespoły mieloproliferacyjne: przewlekła białaczka szpikowa =PBSZ=CML czerwienica prawdziwa osteomieloskleroza = zwłóknienie szpiku ziarnica złośliwa zespół nerczycowy cukrzyca zapalenie zatok przynosowych, ch. uczuleniowe BAZOPENIA - poniżej 20/ul ostre stany uczuleniowe nadczynność tarczycy sterydoterapia

LUC - (k. POX ujemne) Norma – 0 – 4 % LUC erytroblasty, pobudzone limfocyty plazmocyty limfoblasty mieloblasty POX ujemne (M1,M4,M5) LI – wskaźnik płatowości Norma LI – 1,9-3,0 Im niższy tym głębsze LS LI = PMN MN

Analizator – Cobas Micros 45 - ABX

Typ białaczki ALL i NALL CML CLL Rozmaz szpiku kostnego Jednorodna populacja blastów 30 % Norma – do 5 % -dor do 8 % dzieci Obecne wszystkie formy układu granulocytarnego G:E jak 10:1 lub 20:1 Przewaga dojrzałych limfocytów liczne cienie Gumprechta nie wyst. u dzieci WBC HGB PLT , N , nk normocytowa do 1 mln/ul N lub potem NAIH Różnicowanie Klasyfikacja morfologiczna –FAB (L1-L3, M0 – M7) cytochemia (PAS, POX, fosfataza kwaśna Fenotyp – cytometr kariotyp Ph’ eozynofilia i bazofilia w szpiku i na obwodzie FAG do 0 limfocytów z linii B PAS + L powyżej 40 % w szpiku BTA +

ZESPOŁY MIELOPROLIFERACYJNE choroby rozrostowe wywodzące się ze szpiku Podział ostre przewlekłe NALL =AML przewlekła białaczka szpikowa (M0 – M7) czerwienica prawdziwa osteomielofibroza nadpłytkowość pierwotna Istota rozwoju postaci przewlekłej : mutacja komórki macierzystej początkowo niekontrolowany rozrost wszystkich linii szpik bogatokomórkowy stopniowo dominacja rozrostu komórek 1 linii a wypieranie pozostałych linii Cecha charakterystyczna przewlekłych zespołów – zdolność przechodzenia jednej postaci w inną lub przekształcanie w AML

I faza – granulocytarna Włóknienie jam szpikowych I faza – dominacja wszystkich linii - stopniowo Rodzaj Linia dominująca Linia wyparta Konsekwencje P.B.SZ Granulocytarna Erytrocytarna Megakariocytarna Niedokrwistość Małopłytkowość Czerwienica prawdziwa I faza – granulocytarna megakariocytarna (faza schyłkowa) Leukopenia Leukocytoza Nadpłytkowość ( u 50 % chorych) Osteomielo-fibroza = włóknienie szpiku stopniowo Włóknienie jam szpikowych Nadpłytkowość pierwotna Od początku dominuje linia megakariocytarna

Przewlekła białaczka szpikowa stanowi ok. 20 % wszystkich białaczek występuje we wszystkich grupach wiekowych, ale najczęściej między 20 –40 r.ż. niekontrolowany rozrost k.macierzystych ze stopniową dominacją układu granulocytarnego a stłumieniem układu erytro- i płytkotwórczego nacieki i metaplazja pozaszpikowa (wątroba, śledziona) podłoże choroby – zaburzenia genetyczne , u 90 % chorych obecność chromosomu Philadelfia (Ph’ – t (9;22) fuzja genów abl/bcr 3 fazy choroby: przewlekła przyspieszona blastyczna = transormacja blastyczna = kryza blastyczna Faza przewlekła - trwa najdłużej (2-3 lata), przebieg bezobjawowy WBC –60 –100 tys/ul ( spadek masy ciała, zwiększona potliwość, bóle kostne, stany gorączkowe, powiększenie śledziony, wątroby ) Cecha charakterystyczna – FAG do 0

Obraz krwi obwodowej Obraz szpiku kostnego WBC – 60-100 tys/ul – 1 mln/ul - bogatokomórkowy RBC - N - układ granulocytarny ( komórki na PLT – wzrost wszystkich szczeblach rozwoju) OB - wzrost Rozmaz krwi: LS do mieloblasta ( 10 %) - mieloblasty poniżej 30 % bazofili i eozynofili Faza przyśpieszona Faza transformacji blastycznej komórki tracą zdolność do różnicowania i dojrzewania Obraz krwi WBC – 2x wzrost w ciągu kilku dni blasty we krwi 20 % HGB poniżej 10 g/dl blasty + promielocyty we krwi 30 % PLT poniżej 100 tys/ul blasty w szpiku 50 % Rozmaz krwi i szpiku FAG – N lub wzrost blasty we krwi lub w szpiku 10 % mieloblasty + promielocyty 20 %

Przewlekła białaczka szpikowa - CML - obraz krwi obwodowej Przewlekła białaczka limfatyczna - CLL – obraz krwi obwodowej

OSTEOMIELOFIBROZA – ZWŁÓKNIENIE SZPIKU mutacja i niekontrolowany rozrost k. macierzystych z dominacją układu megakariocytarnego mechanizm: PLT i megakariocytów wydzielanie IL-1 pobudzenie syntezy i proliferacji fibroblastów syntetyzujących kolagen zarastanie jam szpikowych 3 fazy: * komórkowa – rozrost k. macierzystych szpik bogatokomórkowy * włóknienia – zarastanie jam szpikowych szpik pusty ( trepanobiopsja !) pancytopenia na obwodzie * kostnienia – przebudowa struktury kości – samoistne łamanie kości metaplazja szpikowa = wytwarzanie pozaszpikowej tkanki krwiotwórczej ( organomegalia, wodobrzusze) choroba dotyczy ludzi w wieku 50-70 lat Obraz krwi obwodowej Obraz szpiku WBC ok. 30 tys/ul leukopenia - zależy od fazy choroby HGB obniżone ( pusty – trepanobiopsja !) małopłytkowość Rozmaz krwi: lakrymocyty LS, wzrost B i Eo

Nadpłytkowość pierwotna niekontrolowany rozrost komórek szeregu megakariocytarnego w szpiku zaburzenia czynności płytek – zaburzenia krzepnięcia ( krwotoki lub zakrzepica naczyń, zatory płytkowe martwica palców) Obraz krwi obwodowej Obraz szpiku PLT powyżej 600 tys – 1mln/ul - bogatokomórkowy WBC powyżej 30 tys/ul - wzrost liczby megakariocytów HGB – N lub nk i skupisk płytek Rozmaz krwi: LS duże skupiska płytek anizocytoza płytek

OSTRE BIAŁACZKI niekontrolowany rozrost wielopotencjalnej komórki macierzystej lub komórek macierzystych ukierunkowanych w zależności od typu linii ulegającej rozrostowi * ostry rozrost linii mieloidalnej (AML = NALL) * ostry rozrost linii limfoidalnej (ALL) typu B i T kryteria rozpoznania ostrej białaczki: * szpik - 30 % blastów *trepanobiopsja 10 % blastów * monotonia komórkowa we krwi i w szpiku * naciekanie przez komórki blastyczne innych narządów * zahamowane różnicowanie i dojrzewanie komórek * przerwa białaczkowa, szczególnie w AML klasyfikacja białaczek: * morfologiczna * cytochemiczna i cytoenzymatyczna * immunofenotypowa i cytogenetyczna

Kryteria morfologiczne ALL (podział FAB): L1 = limfoblastyczna = dziecięca = mikrolimfoblastyczna - blasty jednorodne, małe - jądro regularne, - niewidoczne jąderka - skąpy rąbek cytoplazmy L2 = polimorficzna - blasty różnorodne, większe - jądro nieregularne, - obecne jąderka, - większa ilość cytoplazmy L3 = typ Burkitta - blasty jednorodne, duże - jądro regularne, jąderka 1 lub więcej - wakuolizacja cytoplazmy

Kryteria cytochemiczne w ALL wykrycie substancji charakterystycznych dla limfoblastów: glikogen – w reakcji PAS ( z odcz. Schiffa) kwaśna fosfataza TdT – końcowa transferaza nukleotydowa (wczesny marker ) PAS (+++) (grube czerwone ziarnistości glikogenu w cytoplaźmie) – L1 i L2 PAS (++) – L3 fosfataza kwaśna – obecna w limfoblastach typu T fosfataza kwaśna oporna na kwas winowy – białaczka włochatokomórkowa TdT - obecny we wszystkich z wyjątkiem ALL dojrzałokomórkowe

Limfoidalna k. pnia niezróżnicowana Kryteria immunofenotypowe ALL Ocena obecności antygenów powierzchniowych i komórkowych oraz Ig cytoplazmatycznych i powierzchniowych za pomocą p/c monoklonalnych ALL linii B ( ok.80 % białaczek) Limfoidalna k. pnia niezróżnicowana Pro-B ok. 20 % Common 60 % Pre- B 20 % B-dojrzało- komórkowa 1-4% TdT HLA-DR CD34 CD19 cCD22 CD10 CD22 CD20 cIgM sIgM,G,A łań. kappa, lambda

Limfoidalna k. pnia niezróżnicowana ALL linii T Limfoidalna k. pnia niezróżnicowana Pre -T Z wczesnych T Pośrednich T T-dojrzało- komórkowa 1-4% TdT HLA-DR CD34 CD7 cCD3 CD5 CD34/- CD2 CD4+/- CD8+/- CD1 CD4 CD8 CD3

Kryteria cytogenetyczne ALL u 50 –70 % przypadków wykrywamy anomalie chromosomalne, najczęściej pod postacią translokacji chromosomów t (9;22) ALL typu B ALL typu T t (9;22) - L1 i L2 t lub delecje (9p) proB ALL – t (9;22) t (11;14) t (4:11) cALL - t (9;22) pre-B - t (9;22) t(1;19) B-dojrzałokomórkowa –t(8;14) t (8;22)

Cytometr przepływowy –   Cytometr przepływowy – umożliwia wieloparametryczny pomiar pojedynczej komórki w czasie przepływu zawiesiny komórek Ag + moAb* FITC lub RPE Laser argonowy FS – wielkość komórki SS – ziarnistość komórki FL – fluorescencja

  Antygeny najbardziej charakterystyczne dla : limfocytów T limfocytów B komórek NK monocytów granulocytów  CD2 CD19 CD16 CD14 CD13 CD3 CD20 CD56 CD4 CD33 CD4 CD21 CD8 HLA-DR CD15 CD5 CD22 HLA-DR CD7 CD23 CD8 HLA-DR sIg(G,D,M,E,A)  Antygen wspólny dla całej populacji leukocytów – CD45

Przykładowy panel diagnostyczny do określenia fenotypu subpopulacji limfocytów krwi obwodowej:   IgG1FITC/IgG1PE (izotypowa kontrola negatywna) CD45 FITC /CD14 PE (leukocyty/monocyty) CD2 FITC /CD19 PE ( LT/LB) CD3 FITC /CD22 PE ( LT/LB) CD4 FITC /CD8 PE ( LT pomocnicze/LT supresorowe/cytotoksyczne) CD5 PE /CD20 FITC ( LT/LB) HLA-DR FITC /CD4 PE ( LT aktywowane) CD3 FITC /CD16/56 PE (komórki NK) Inne antygeny powierzchniowe wykorzystywane w diagnostyce hematologicznej CD34 – komórki macierzyste, progenitorowe CD10 – antygen CALLA (wspólny) CD41 - komórki płytkowe i ich prekursory CD117 – komórki macierzyste

Przykładowy panel diagnostyczny do określenia fenotypu komórek szpiku (ostra białaczka): antygeny powierzchniowe: antygeny cytoplazmatyczne: IgG1/IgG1 cyt. łańcuch ciężki  CD45/CD14 cyt. MPO CD7/CD13, CD7/CD33, CD15 cyt.CD3 HLA-DR/CD34 cyt.CD22 CD2/CD19 , CD3/CD22 CD10/CD19 CD4/CD8 , CD5/CD20   Antygeny dominujące w różnych typach białaczki:  Ostra białaczka mieloblastyczna – AML  CD45, CD13, CD33, CD34, CD15, HLA-DR, cyt MPO   Ostra białaczka limfoblastyczna z linii B – ALL B  CD45, CD19, CD22, CD20, HLA-DR, CD34, cyt.łańcuch , Ig powierzchniowe, cyt.CD22   Ostra białaczka limfoblastyczna z linii T – ALL T  CD45, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD34, cyt.CD3  

ALL common z koekspresją CD13

ALL T

AML z koekspresją CD7 CD15

Kryteria morfologiczne- FAB PODZIAŁ NALL = AML Kryteria morfologiczne- FAB M0 – niezróżnicowana mieloblastyczna M1 – mieloblastyczna bez cech dojrzewania ( pałeczki Auera) M2 – mieloblastyczna z cechami dojrzewania ( poj. promielocyty) M3 – promielocytowa ( liczne promielocyty + pałki Auera) M4 – mielomonocytowa ( ok. 80 % mieloblastów 20 % monoblastów i M M5 – monocytowa ( ok. 80 % monoblastów 20 % ukł. granulocytarny) M6 – erytroleukemia ( 50 % ukł. czerwonokrwinkowego atypowe erytroblasty 30 % mieloblasty) M7 – megakarioblastyczna ( megakariocyty, patol. płytki)

I typ – POX – peroksydazowy II typ peroksydazo-esterazowy Kryteria cytoenzymatyczne i cytochemiczne AL W 1969 r. Loffler wprowadził 5 stopniową klasyfikację na podstawie reakcji PAS, POX (lub Sudan czarny) i obecności esterazy nieswoistej alfanaftolu I typ – POX – peroksydazowy II typ peroksydazo-esterazowy blasty POX + blasty POX + PAS – , esterazo – PAS -, esterazo + 5 % blastów POX + - M1-M2 25 –50 % blastów + - M4 65 % - M3 III typ esterazowy IV typ PAS blasty PAS – ok. 100 %blastów PAS + : L1- L3 POX +/- M5 POX - ! M6 ponad 50% blastów esterazo+ (3-4+) V typ niezróżnicowany – M0 M7 sudan czarny blasty POX – blasty POX - M1-M3 + PAS – PAS - L1-L3 - esterazo + esterazo -

Kryteria immunofenotypowe NALL M1 - CD65, CD34 M2 – CD13, CD33 M3 – CD15 M4 i M5 – CD14 M6 – glikoforyna A M7 – CD41, CD42, CD61 Kryteria cytogenetyczne M1 – t(8;21 t (9;22) M2 – t(8;21) M3 – t(15;17) M4 – inv lub del (16) M5 –inw lub t(11) M6 - aneuploidia