Podsumowanie - wykład 2 Struktura kwasów nukleinowych ( DNA i RNA) Dwuniciowa helisa DNA ( typy helis DNA) Rodzaje i funkcje RNA (podział funkcyjny; wielkość cząsteczek) Właściwości kwasów nukleinowych - stabilność, wpływ niskiego i wysokiego pH, denaturacja chemiczna, denaturacja termiczna, gęstość) 5. Metody izolacji kwasów nukleinowych (założenia i etapy) 6. CTAB dla DNA, TRIZOL (TRI) dla RNA; zestawy komercyjne 7. Ocena stopnia czystości i ilości preparatów DNA i RNA Pomiary spektrofotometryczne Elektroforeza w żelu agarozowym;

TYPY HELIS DNA Dwuniciowe helisy A, B, Z A B Z Forma B - DNA – prawoskrętna, zidentyfikowana przez Watsona i Cricka występuje in vivo w każdym DNA; Forma A - DNA – prawoskrętna, powstaje w warunkach niskiej wilgotności, jej struktura jest szersza i krótsza niż formy B in vivo hybrydach DNA-RNA Dwuniciowe helisy A, B, Z Forma Z - DNA – lewoskrętna, powstaje w dwuniciowym DNA, w którym zasady pirymidynowe i purynowe występują po sobie na przemian np. CGCGCG; w normalnym DNA tworzy się b. rzadko. A B Z

IZOLACJA CAŁkowitego DNA Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu; Izolacja z wysoleniem białek Izolacja poprzez związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA ( zestawy komercyjne – izolacja DNA na kolumienkach) Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych jest pierwszym etapem większości procedur wykorzystywanych w biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Podstawowym celem tego etapu jest uzyskanie czystego materiału (oczyszczenie z białek i inhibitorów enzymów) o niskim stopniu degradacji, w ilości wystarczającej do przeprowadzenia reakcji PCR bez względu na materiał z jakiego jest przeprowadzana izolacja. Pierwsze procedury izolacji DNA były właściwie zmienionymi metodami izolacji polisacharydów.

ETAPY IZOLACJI DNA Fizyczne zniszczenie struktury tkankowej i komórkowej materiału biologicznego, tzw. homogenizacja. Uwolnienie DNA - DNA chroniony jest w komórce w różnych błonowych strukturach subkomórkowych, takich jak np.: jądro, mitochondria. W celu degradacji błon komórkowych i białek, do buforów ekstrakcyjnych dodawane są różne detergenty. Usunięcie zdegradowanych elementów komórkowych. Oddzielenie DNA (wytrącanie) od związków użytych na wcześniejszych etapach izolacji, (detergentów, soli). Przygotowanie DNA do przechowywania.

IZOLACJA CAŁKOWITEGO RNA Metoda izolacji wg Chomczyńskiego i Sacchi (1987) ZASADA: Izotiocyjanian guanidyny należy do substancji najefektywniej denaturujących białka. Jest on także silnym inhibitorem rybonukleaz. Metoda ta opiera się na ekstrakcji izotiocyjaninem guanidyny i mieszaniną fenol/chloroform w środowisku kwasowym. RNA extraction with TRIzol (Invitrogen product name) or the equivalent TRI (Sigma-Aldrich product name) is a common method of total RNA extraction from cells based on the research of Chomczynski P, Sacchi N. 1987 [1] and reviewed by the authors again in 2006 [2]. It takes slightly longer than column-based methods like RNAeasy but it has higher capacity and can yield more RNA. Along with chaotropic lysis buffers it is generally considered the method that gives the best quality RNA.

Czystość preparatów DNA i RNA Po rozdziale elektroforetycznym całkowitego RNA w żelu agarozowym najlepiej widoczne są frakcje rRNA (Rys. 1). Ich obraz może być wykorzystany jako orientacyjny marker mas cząsteczkowych, gdyż znane są wielkości podstawowych frakcji rRNA występujących u poszczególnych organizmów. Intensywność prążków rRNA informuje nas o jakości preparatu, ich zanikanie świadczy o postępującej degradacji RNA. Frakcje mRNA, ze względu na ich niewielką ilość w preparacie oraz zróżnicowaną wielkość, charakterystyczną dla poszczególnych genów, nie są widoczne na żelach po rozdziale RNA całkowitego (Rys. 1. Żel agarozowy całkowitego RNA). Czystość preparatów DNA i RNA można określić obliczając stosunek: A260/A280nm; Czysty DNA ma A260/A280 nm= 1.8; czysty RNA = 2.0; Wartość A260/A280 = 1.5 oznacza zanieczyszczenie białkiem w około 50 %.

Elektroforeza w żelu agarozowym Agaroza Polisacharyd oczyszczany z glonów morskich (krasnorostów); Właściwości agarozy / żelu agarozowego: -transparentność –dobrze widoczne rozdzielane fragmenty - brak obecności DNaz /RNaz - niski punkt topnienia - wysoka wytrzymałość żelu - wysoka rozdzielczość produktów PCR oraz fragmentów DNA w zakresie 100 -10 000 pz( szeroki zakres stężeń) - bardzo niskie tło fluorescencji przy barwieniu bromkiem etydyny Agaroza to frakcja agaru oczyszczona z krasnorostów, w postaci handlowej jest białym lub lekko żółtym proszkiem. Jest to polisacharyd zbudowany z około 800 liniowo połączonych reszt heksozy (inaczej – 400 reszt agarobioza). Agarobioza jest dwucukrem zbudowanym z D-galaktozy i 3,6-anhydro-L-galaktozy. będący polimerem pochodnych galaktozy. Powstawanie żelu agarozowego jest reakcją odwracalną, w wyniku której pojedyncze, losowo zwinięte łańcuchy układają się w dwuniciową, helikalną strukturę III-rzędową, które rozgałęziają się tworząc sieć. Agaroza rozpuszcza się bardzo łatwo w gotującej się wodzie i pozostaje w stanie płynnym aż do temperatury około 40°C. Poniżej tej temperatury zestala się w postaci porowatego żelu. Po zestaleniu pozostaje w tej postaci nawet w podwyższonych temperaturach sięgających kilkudziesięciu °C. Rozmiary porowatości można regulować stosując agarozę w różnych stężeniach. Im wyższe jest stężenie agarozy, tym bogatsze jest usieciowanie i drobniejsze są pory. Zwykle przygotowuje się żele o stężeniach agarozy z przedziału 0,4-2,0%. Zaletą żeli agarozowych jest łatwość i szybkość ich przygotowania oraz możliwość separacji dużych makromolekuł np. DNA i RNA. Wadą zaś jest słaba wytrzymałość mechaniczna żeli oraz trudność ich utrwalania po rozdziale. Wyschnięte żele rozsypują się pod wpływem bardzo niewielkich sił. Żel agarozowy stosuję się do rozdzielania DNA o szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Wadą elektroforezy w żelu agarozowym jest słaba rozdzielczość frakcji DNA różniącego się poniżej 5% wielkości. Elektroforeza w żelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE×1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA, pH 8) lub TAE×1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8). Kiedy żel zostaje poddany działaniu pola elektrycznego w obecności buforu przewodzącego prąd fragmenty kwasów nukleinowych przemieszczają się w kierunku elektrody dodatniej ( anody), a szybkość ich migracji zależy od wielkości i kształtu. Małe fragmenty liniowe poruszają się szybciej niż większe, których ruch jest hamowany przez plątaninę włókien agarozy.