Podsumowanie Wirusy jako wektory Ekspresja przejściowa z wykorzystaniem wektora wirusowego Przykłady wirusów roślinnych funkcjonujących jako wektory: Wirus mozaiki stokłosy BMV Wirus tytoniu TRV 4. Wyciszanie genów przy pomocy wirusa TRV 5. Geny markerowe w konstrukcie genowym Geny selekcyjne Geny reporterowe 6. Cechy genu reporterowego 7. Białka reporterowe i ich zastosowanie ( GUS, GFP, lucyferaza) 8. Techniki wykrywania GMO PCR Immunodetekcja ( ELISA) Obecność terminatora Odporność na antybiotyki i herbicydy – przykłady Detoksykacja Stymulacja rozwoju in vitro Modyfikacja węglowodanów

Wirusy jako wektory Ekspresja przejściowa – wprowadzenie genu do ukształtowanego organizmu i dostarczenie go do wielu komórek i tkanek za pomocą zmodyfikowanych wirusów. +Łatwość infekcji +Duża ilość wbudowywanych kopii = wysoka ekspresja wprowadzanych genów +Dowolny moment infekcji podczas rozwoju rośliny - Limitowana wielkość wprowadzanego DNA (0,8 kpz) Infekcja wirusowa może być letalna dla komórek gospodarza Błędna synteza wirusowego RNA = błędna ekspresja wprowadzanych genów

Przejściowa ekspresja obcych genów przy użyciu wektora wirusowego Możliwość produkcji dużej ilości białek (synteza produktu z obcego genu 0,4-2% rozpuszczalnych białek rośliny).

Wyciszanie genów metodą VIGS (Virus Induced Gene Silencing) Wirus TRV tytoniu z dwudzielnym genomem: RNA1 i RNA2; RNA1 – zawiera replikazę, sekwencję kodującą movement protein i białko bogate w cysteinę RNA2 – białka płaszcza i dwa białka strukturalne, które nie są niezbędne do funkcjonowania wirusa; W miejsce sekwencji kodującej białko strukturalne wstawiono fragment z miejscami restrykcyjnymi do klonowania obcego DNA; Mieszaniną komórek bakteryjnych Agrobacterium z TRV- RNA1 i TRV-RNA2 infekowano liście pomidora, a odtworzony wirus rozprzestrzeniał się i przenosił sekwencję wprowadzoną w jego MCS. *Wyciszenie genu syntazy fitoenu – kluczowego enzymu syntezy karotenoidów

Geny markerowe Geny markerowe Geny selekcyjne Geny reporterowe ułatwiają szybkie rozpoznanie transformantów i zmniejszają ryzyko regenerowania roślin mozaikowych zawierających komórki stransformowane i nie transformowane; Geny selekcyjne Geny reporterowe Geny markerowe nadają komórkom zdolność do podziałów i regeneracji roślin na pożywce zawierającej antybiotyk (zwykle kanamycynę lub higromycynę) lub herbicyd (zwykle preparaty Basta lub Round-up) i w związku z tym toksycznej dla komórek dzikiego typu (nie transformowanych). Geny selekcyjne geny reporterowe, zwane też wizualizującymi, powodują zmiany w wyglądzie i składzie chemicznym roślin - zwykle gromadzenie jakiegoś barwnika (tak działa gen β-glukuronidazy czyli GUS) lub świecenie (geny lucyferazy z bakterii - LUX lub owadów świetlików - LUC Geny reporterowe

Przykłady genów reporterowych Gen Białko - produkt genu Pochodzenie genu Katalizowana reakcja Metoda analizy Obraz ekspresji GUS (uidA) Escherichia coli hydroliza glukuronidów np.: X-Gluc spektrofotometryczna, fluorymetryczna, histochemiczna niebieski barwnik LUC (luc) lucyferaza Photinus pyralis Utlenianie lucyferyny zależne od ATP; towarzyszy mu emisja światła luminometryczna, fotoluminescencyjna żółto-zielone świecenie własnym światłem GFP (gfp) Białko zielono fluoryzujące Aequorea victoria Proces fluorescencji fluorymetryczna, mikroskopia fluorescencyjna zielone świecenie obiektów oświetlonych niebieskim lub nadfioletowym światłem CAT (cat) acetylotransferaza chloramfenikolu Escherichia coli Acetylacja chloramfenikolu chromatografia ciekowarstwowa, autoradiografia, spektofotometryczna, densytometryczna, pojawienie się produktów acetylacji antybiotyku na chromatogramie (a dokładniej na autoradiogramie)*

Techniki detekcji GMO PCR – analiza kwasów nukleinowych (materiał świeży całe rośliny, organy) Immunodetekcja - analiza produktów białkowych transgenu (materiał przetworzony); ELISA- test immunoenzymatyczny (ang. enzyme linked immunosorbent assay) Obecność terminatora np. E9 3’ z genu małej podjednostki Rubisco z grochu, terminator genu syntazy nopalinowej z Agrobacterium Analiza odporności na antybiotyki lub herbicycy np. gen bla –kodujący β-laktamazę zapewniającą odporność na ampicylinę i penicylinę, gen Tn5 – kanamycynę; bar/pat- acylotransfereza fosfinotrycyny – nadaje odporność na wiele herbicydów np. Basta, Ignite, Liberty.

Selekcja GM na podstawie detoksykacji Geny kodujące enzymy zdolne do przekształcania substancji toksycznych w ich nietoksyczne pochodne. DOG R1 – produkuje fosfatazę 2- deoksyglukozylo-6-fosforanową, która katalizuje przemianę szkodliwego dla roślin fosforanu 2-deoksyglukozy w 2-deoksygukozę

Modyfikacja węglowodanów Wykorzystanie do selekcji węglowodanów: Gen izomerazy fosfomannozy pmi- umożliwia zmianę 6-fosforanu mannozy do 6 fosforanu glukozy, który jest łatwo metabolizowany przez rośliny. Selekcję opartą na wprowadzeniu genu pmi zastosowano u roślin jedno i dwuliściennych (pszenicy, kukurydzy, buraku cukrowym, ogórku i drzewach owocowych) xylA- katalizuje przekształcenie ksylozy w D-ksylulozę, która może być wykorzystana jako źródło C przez komórki roślinne; selekcja z wykorzystaniem ksylozy sprawdziła się u tytoniu, pomidora i ziemniaka, a wydajność transformacji była wyższa niż przy użyciu wektora z genem nptII.