Biomonitoring stanu środowiska

Biomonitoring Bioindykatory – organizmy używane jako wskaźniki stanu środowiska Biomarkery – składniki materii ożywionej (najczęściej biomakromolekuły) używane jako elementy układów analizujących stan środowiska Biosensory – wyizolowane biomarkery wbudowane w układy pomiarowe

Bioindykatory Organizmy, które wykorzystuje się do identyfikacji i pomiaru wpływu polutantów na stan środowiska. Cechy dobrego bioindykatora: - gatunek szeroko rozpowszechniony - w niewielkim stopniu mobilny - dostępny przez cały rok - łatwy do zbierania - charakteryzujący się wysokim współczynnikiem zatężania polutanta - wrażliwy na działanie polutanta

OrganizmPolutantCharakter Dżdżownica Pszczoła miodna Porosty Mchy Płastuga zimnica (Limanda limanda) Krab semaforowy (Heloecius cordiformis) Małże 2,4,6-trinitrotoluen Metale Zanieczyszczenia powietrza DDT Metale ciężkie Metale Toksyczność Ekstrahowane z pszczół i z miodu Parametry fizjologiczne Zawartość metali Wady rozwojowe Ekstrahowane z organów Zawartość w tkankach miękkich Przykłady bioindykatorów

Biomarkery Ilościowe wskaźniki zmian zachodzących w systemach biologicznych w odpowiedzi na pojawienie się w środowisku ksenobiotyków. Biomarkery mogą mieć charakter biochemiczny, immunochemiczny lub genetyczny. Reakcje fazy I metabolizmu ksenobiotyków

Biomarkery biochemiczne Rolę biomarkerów pełnić mogą białka (w tym enzymy) i metabolity wewnątrzkomórkowe. Ilość, a co za tym idzie aktywność enzymów metabolizujących ksenobiotyki wzrasta w organizmach wystawionych na działanie danego ksenobiotyku. Wzrost aktywności enzymu jest w tym przypadku miarą efektu biologicznego. OrganizmOznaczeniePolutant Ostryga (Crassostrea gigas) Małze (Mytilus edulis) Rośliny Małże (Unio tumidus) Rozgwiazda (Asterias rubens) Transgeniczny obleniec Caenorhabditis elegans (zawiera gen lacZ z E.coli połączony z genem hsp16) Metalotioneiny Glutation EROD, AHH Enzymy GSH-zależne Cytochrom P450, hydroksylaza benzopirenowa -galaktozydaza Metale Dioksyny Miedź PAH różne EROD – o-detylaza etoksyrezorufinowa; AHH – hydroksylaza węglowodorów arylowych; GSH – glutation; PAH – policykliczne węglowodory aromatyczne

Biomarkery immunochemiczne Rolę takich biomarkerów pełnią przeciwciała specyficznie wiążące antygeny pochodzące od ksenobiotyków. Specyficzność ta wykorzystywana jest w testach ELISA. Biomarkery genetyczne Zasadą metody jest wykorzystanie genów kodujących białka emitujące światło lub wywołujące efekt barwny, wbudowanych w taki sposób, aby odpowiedź (świecenie, zmiana barwy) powstawała w odpowiedzi na obecność polutanta. Odpowiedź barwna – przykłady Gen gusA kodujący białko rozszczepiające X-gal, połączony z obszarem promotorowym uaktywnianym przez polutant. Szczep E. coli zawierający plazmid z genem lacZ, połączonym z genem kodującym arsR – białko regulatorowe operonu ars (odpowiedzialnego za usuwanie antymonu i arsenianów). Aktywność -galaktozydazy wytwarzanej w takich komórkach w obecności arsenianów lub antymonu, może być oznaczana z użyciem chromogennego substratu.

Mechanizm odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego Testy ELISA

Rodzaje immunoglobulin

Testy ELISA Struktura przeciwciała IgG

Testy ELISA Antygeny makromolekuły (białka, polisacharydy, kwasy nukleinowe) wywołujące biosyntezę przeciwciał Determinanta antygenowa/Epitop Fragment antygenu rozpoznawany przez przeciwciało Hapteny Małe, obce cząsteczki zawierające epitopy rozpoznawalne przez przeciwciała. Hapten może indukować tworzenie przeciwciała pod warunkiem, że jest połączony z makromolekularnym nośnikiem

Testy ELISA Przeciwciało monoklonalne – przeciwciało specyficzne wobec danego antygenu, o zdefiniowanej sekwencji łańcuchów polipeptydowych; wytwarzane przez komórki klonalne (jednego genotypu) w hodowli tkankowej Przeciwciała poliklonalne – zestaw przeciwciał monoklonal- nych, wiążących dany antygen, wytwarzanych przez immunizowany organizm zwierzęcy

Testy ELISA Preparatyka przeciwciał monoklonalnych

Testy ELISA Zasada dwóch technik ELISA

Białka luminescencyjne Lucyferaza bakteryjna – gen luxAB Lucyferaza eukariotyczna – gen luc Zielone białko fluoryzujace (GFP) z meduzy Aqorea victoria – gen gfp Przykład zastosowania: Szczep E. coli, w którym gen luxAB z Vibrio harveyi znajduje się pod kontrolą promotora alkB z Pseudomonas oleovorans. Komórki odpowiadają świeceniem na obecność alkanów. Biomarkery genetyczne

Testy toksyczności Rodzaje testów: 1.Testy przeżywalności (wyznaczanie wartości LC 50, głównie organizmy wodne) 2.Testy wzrostowe (bakterie, grzyby, glony, wyznaczanie wartości EC 50 ) 3.Testy enzymatyczne – hamowanie aktywności enzymu lub grupy enzymów u wybranych bioindykatorów 4.Testy genotoksyczności (mutagenności) 5.Testy bioakumulacji

Testy toksyczności Przykłady organizmów wykorzystywanych w testach toksyczności Bakterie: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Vibrio Grzyby: Candida, Saccharomyces, Penicillium, Aspergillus Glony: Chlorella, Scenedesmus, Selenastrum Pierwotniaki: Spirostomum, Vorticella, Paramaecium Wrotki: Brachionus Skorupiaki: Daphnia, Gammarus, Artemia, Mysis, Asellus, Hyalella Owady: Ephemerella, Hydropsyche, Chironomus Mięczaki: Physa acuta, Planorbarius coernus, Dreissena polymorpha Ryby: Lebistes reticulatus (Gupik pawie oczko), Brachydanio rerio (Danio pręgowany) ), także innych 150 gatunków

Testy toksyczności Testy z wykorzystaniem roślin i glonów Poziom troficzny TypPrzykłady Pierwotni producenci Konsumenci I rzędu Konsumenci II rzędu, mięsożercy Konsumenci III rzędu Konsumenci IV rzędu ptaki drapieżne Chlorella vulgaris, Selenastrum capricornutum, Senendesus quadricauda, Lemna spp. Rozwielitki (Daphnia spp., krewetki (Artemia salina) Brak Ryby, m.in.: płoć, pstrąg tęczowy gołąb, przepiórka, bażant pustułka, myszołów Kolorem czerwonym zaznaczono organizmy najpowszechniej wykorzystywane w testach. Testy polegają na podaniu hodowli glonów działaniu związku przez 3 – 4 dni i określeniu wartości EC 50. W przypadku organizmów poziomu 2 ekspozycja trwa 24 h.

Testy toksyczności Testy z wykorzystaniem bakterii luminescencyjnych Miarą toksyczności jest redukcja emisji światła przez bakterie świecące. Porównuje się poziom emisji światła próbek hodowli poddanych działaniu związku badanego z poziomem emisji hodowli kontrolnej.

Bakterie świecące Wzrost Vibrio fischeri na podłożu agarowym BOSS, Z lewej – zdjęcie przy oświetleniu normalnym; z prawej – zdjęcie wykonane w ciemności przy czasie ekspozycji 40 s. Morfologia Vibrio fischeriKolonie bakterii Photobacterium luciferum

Na podstawie materiałów z National Centre for Biotechnology Education. Autor rysunków: Paul Stevens

Testy toksyczności System BIOTOX do określania toksyczności związków chemicznych BIOTOX - test wykorzystujący bakterie luminescencyjne Vibrio fischeri. Reakcją testową jest obniżenie luminescencji (świecenia) bakterii. Czas inkubacji jest wyjątkowo krótki – tylko 15 minut. Test wykonuje się wg standardowej procedury producenta, przy użyciu analizatora i liofilizowanych bakterii.

Spirotox - test wykorzystujący pierwotniaki Spirostomum ambiguum. W teście tym obserwuje się dwa rodzaje reakcji testowych: deformacje komórki oraz śmierć komórki. Na podstawie wyników obliczane są dwie wartości: EC 50 – stężenie wywołujące 50% przyżyciową reakcję testową oraz LC 50 – stężenie wywołujące 50% śmietelną reakcję testową. Standardowy czas trwania testu (inkubacji) wynosi 24 godziny, chociaż w wielu przypadkach reakcje testowe występują już po 2 godzinach. Protoxkit F - Toxkit wykorzystujący pierwotniaka Tetrahymena termophila. Reakcją testową jest inhibicja wzrostu pierwotniaków. Jej miarą jest spadek gęstości pokarmu (bakterii) mierzony spektrofotometrycznie. Jest to test chroniczny pozwalający w ciągu jedynie 24 godzin ocenić wpływ badanej próbki na kilka pokoleń pierwotniaków. Rotoxkit F - Toxkit wykorzystujący wrotka Brachionus calyciflorus. Reakcją testową jest śmierć organizmu. Daphtoxkit F magna - Toxkit wykorzystujący skorupiaka Daphnia magna. Standardowy test toksyczności przeprowadzony wg zaleceń OECD. Reakcją testową jest zahamowanie ruchu skorupiaków (immobilizacja) obserwowana po 24 i 48 godzinach inkubacji. Test wykonuje się przy zastosowaniu dafni świeżo wylęgłych z jaj przetrwalnych (Creasel, Deinze, Belgia). Procedura ta umożliwia eliminację ciągłej hodowli organizmów. Thamnotoxkit F - Toxkit wykorzystujący skorupiaka Thamnocephalus platyurus. Reakcją testową jest śmierć skorupiaków. Test wykonuje się przy zastosowaniu organizmów świeżo wylęgłych z jaj przetrwalnych (Creasel, Deinze, Belgia). Test ten polecany jest jako tańsza alternatywa dla testu Daphnia. W wielu przypadkach test ten jest bardziej czuły na obecność substancji toksycznych niż standardowy test Daphnia.

Testy toksyczności

Polskie normy badania toksyczności: glony Chlorella vulgaris, skorupiaki Daphnia magna i Gammarus varoviensis oraz ryby Lebistes reticulatus Normy ISO EN ISO 6341 Test oparty na hamowaniu mobilności Daphnia magna EN ISO 7346 Test pomiaru toksyczności wobec Brachydanio rerio EN ISO Test hamowania wzrostu Selenastrum capricornutum, Senendesus subspicatus ISO Test toksyczności z wykorzystaniem bakterii luminescencyjnych Vibrio fischeri ISO Test hamowania wzrostu Pseudomonas putida ISO Test przedłużonej toksyczności – wpływ na tempo wzrostu pstrąga tęczowego

Mutageneza Typy mutacji 1.Substytucja zamiana zasady na inną - tranzycja A G lub C T - tranwersja A lub G T lub C 2.Delecjausuniecie jednej lub większej liczby zasad 3.Insercjawstawienie jednej lub większej liczby zasad Mechanizmy molekularne: -modyfikacja chemiczna -wprowadzenie analogu zasady -interkalacja -modyfikacja fizyczna (UV, promieniowanie gamma) Testy genotoksyczności

genotyp wyjściowy mutagen (1) (2) genotyp uszkodzony (3) (4) komórki zabite genotyp trwale zmutowany (5) (6) populacja mutantów 1 – mutacje pierwotne 2 – mechanizm naprawczy; odtworzenie stanu pierwotnego 3 – mechanizm naprawczy; mutacje wtórne 4 – śmierć komórki 5 – śmierć komórki 6 – namnażanie zmutowanych komórek Mutageneza Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy

Czynniki mutagenne Związki alkilujące Barwniki akrydynowe prowadzą do powstania mutacji przesunięcia ramki odczytu w wyniku interkalacji pomiędzy pary zasad DNA Efektem działania kwasu azotowego(III) jest możliwość mutacji w wyniku tranzycji A-T C-G

Mechanizm tworzenia mutagennych pochodnych benzo[a]pirenu Czynniki mutagenne

Testy genotoksyczności (mutagenności a/ Płytka kontrolna; b-d/ płytki z krążkami zawierającymi związek mutagenny. Stężenie związku było najwyższe na płytce b, a najniższe na płytce d. Wszystkie płytki zostały zaszczepione identyczną liczbą komórek Salmonella typhimurium (His-). Test Amesa Stosuje się mutanty Salmonella typhimurium niezdolne do biosyntezy aminokwasu L-histydyny. Bakterie wysiewa się na podłożu agarowym minimalnym, nie zawierającym histydyny. Związek aplikowany jest na powierzchnię płytki na krążku bibułowym, często wraz z ekstraktem z wątroby szczura. Jeżeli pod wpływem badanego związku nastąpi rewersja do prototrofii (co objawi się w postaci kolonii bakteryjnych), uznaje się związek za genotoksyczny.

Testy genotoksyczności (mutagenności) SOS-Chromotest Zasada polega na indukcji przez badane związki układu SOS do naprawy uszkodzonego DNA. Gen regulujący ekspresję genów układu SOS (umuC) jest połączony z genem indykatorowym, np. regulującym ekspresję genu kodującego -galaktozydazę. Wzrost aktywności -galaktozydazy stanowi miarę genotoksyczności. Umu-test Procedura podobna do metodyki testy SOS-Chromotest. Stosuje się mutanty Salmonella typhimurium z plazmidem zawierającym gen umuC. Test Mutatox Stosuje się mutanty Vibrio fischeri niezdolne do bioluminescencji. Pod wpływem związków genotoksycznych następuje aktywacja świecenia.

Porównanie odpowiedzi różnych biomarkerów i bioindykatorów na pentachlorofenol OrganizmTypIndykatorCzas ekspozycji (h) EC 50 ( M) Chlorella vulgaris Daphnia magna Allium cepa Sunfish Płoć Pstrąg tęczowy Vibrio fischeri Komórki linii RTG-2 Komórki linii Vero Mikroglony Skorupiak Roślina Ryba Bakteria Pstrąg tęczowy Małpa Hamowanie wzrostu Immobilizacja Indeks mitotyczny Śmiertelność Luminescencja Pobieranie barwnika Hamowanie wzrostu Redukcja MTT ,2 10 0,2 1,76 0,35 1,

Biosensory Wyizolowane biomarkery wbudowane w układy pomiarowe. Układ pomiarowy składa się z biosensora, transduktora przetwarzającego sygnał biologiczny na sygnał elektryczny i integratora/rejestratora

Biosensory Czynnik mierzony BiosensorTransduktor BZT5 Atrazyna, estron, izoproturon Fenol Azotany Fosforany Metale ciężkie Herbicydy Pestycydy Immobilizowane komórki bakeryjne Photobacterium phosphoroeum Przeciwciała Peroksydaza z chrzanu Agrobacterium radiobacter Reduktaza azotanowa z Alcaligenes faecalis Oksydaza pirogronianowa Fitochelatyna Immobilizowane komórki Chlorella vulgaris Esteraza acetylocholinowa Elektroda tlenowa Fotodioda Fotopowielacz Amperometr Konduktometr Amperometr Czujnik optyczny Konduktometr

Biosensory Porównanie konstrukcji elektrody tlenowej i biosensora BZT 5. W biosensorze komórki drobnoustroju są immobilizowane pomiędzy przepuszczalną dla gazów (w tym tlenu) membraną teflonową a przepuszczalna dla składników środowiska membrana zewnętrzną. Im większa zawartość metabolizowalnych składników w środowisku, tym większa aktywność metaboliczna komórek, a co za tym idzie, szybsza redukcja poziomu tlenu.