Podsumowanie – wykład 5 Transformacje komórek roślinnych – rośliny GMO Metody transformacji wektorowe bezwektorowe Typy wektorów: -plazmidowe -fagowe -hybrydowe (kosmidy) -sztuczne chromosomy (BAC, YAC) -wektory binarne Transformacja wektorowa z użyciem Agrobacterium tumefaciens i rhizogenes plazmid Ti (T-DNA) zanurzanie kwiatów w zawiesinie bakteryjnej (floral dip) Transformacje bezwektorowe Mikrowstrzeliwanie Włókna krzemowo-karbidowe PTP-pollen tube pathway

Transformacja genetyczna Transformacja genetyczna polega na wprowadzeniu fragmentu DNA dawcy (jednego lub kilku genów) do genomu biorcy nadając mu nowe, unikalne cechy. GMO – genetically modified organism GM Rośliny poddane transformacjom (rośliny transgeniczne) z konstruktami genowymi są: odporne na herbicycy odporne na choroby odporne na owady roślinożerne odporne na niekorzystne warunki środowiska z poprawionymi cechami użytkowymi np. lepsze plonowanie, większa zawartość składników odżywczych, witamin

Metody transformacji roślin TRANSFORMACJE WEKTOROWE wykorzystują bakterie (wektory plazmidowe,wektory fagowe) BEZWEKTOROWE transformacja protoplastów, mikrowstrzeliwanie, włókna krzemowo-karbidowe, PTP (polen tube pathway)

Wektory Wektory plazmidowe Typowe modyfikacje: Plazmid – pozachromosomowa, kolista cząsteczka DNA zawierająca niezależny początek replikacji; wektory plazmidowe są plazmidami sztucznie zmodyfikowanymi; pozwalają na klonowanie fragmentów DNA do 10 kpz; Wektory plazmidowe Typowe modyfikacje: Stałe miejsce do klonowania zawierające szereg unikalnych miejsc restrykcyjnych (polilinker) Obecność co najmniej jednego markera selekcyjnego (np. oporności na antybiotyki AmpR) Miejsce ori –(repilikacja) determinuje obecność setek kopii plazmidu na pojedynczą komórkę Sekwencje promotorów polimerazy RNA

Transformacja wektorowa Mikroorganizmy posiadają w swojej komórce plazmid, który zawiera zakodowaną informację o białkach niezbędnych do zaatakowania rośliny. To właśnie on wnika do komórki roślinnej, a jeden z jego fragmentów, nazwany odcinkiem T-transfer (T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza. Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego Usuwając geny znajdujące się wewnątrz fragmentu T, można na ich miejsce wstawić dowolny inny fragment DNA, który może zawierać geny pochodzące z innego organizmu. Obecnie do transformacji roślin używa się plazmidów pochodzących z Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens naturalnie infekuje (najczęściej w miejscu zranienia) ponad 160 gatunków roślin powodując guzowatość * * żeby bakteria była onkogenna musi zawierać plazmid Ti (ang. Tumor inducing).

Plazmid Ti z Agrobacterium tumefaciens Analiza genetyczna wykazała, że dwa regiony plazmidu Ti są niezbędne do powstania guza: T-DNA i region vir (virulence). T-DNA zawiera geny związane z produkcją fitohormonów (auksyn, cytokinin) Nadprodukcja tych hormonów podwyższa tempo podziału komórki, zapobiega różnicowaniu i w rezultacie powoduje powstanie guza Inne geny T-DNA odpowiedzialne są za syntezę aminokwasów i pochodnych argininy zwanych opinami, (źródło C i N) oraz za ich wydzielanie z komórki roślinnej; Rodzaj syntetyzowanych opin jest podstawą klasyfikacji plazmidów: np..nopalinowe, oktopinowe, atropinowe. Fragment T-DNA jest ograniczony krótkimi (24-25 n) sekwencjami granicznymi LB i RB (miejsca nacięcia T-DNA) 200kpz

Geny wirulencji (vir) Fragment vir (ang virulence) znajdujący się poza T-DNA o wielkości od 30-40 kpz zawiera geny zaangażowane w proces transformacji położone w obrębie 6 operonów: virA (1) virB (11) virC (2) virD (4) virE(2) virG (1) virF (1) virH (2) A B C D E G Nie są związane z przenoszeniem T-DNA; ale istotne dla transformacji niektórych gatunków np. virF- kukurydza Operony virA i virG ulegają stałej ekspresji na niskim poziomie; produkt białkowy virA jest białkiem transmembranowym reagującym na związki fenolowe i monocukry wydzielane przez zranioną tkankę roślinną. Aktywuje również białko virG, które działa jako czynnik transkrypcyjny dla pozostałych vir. Vir D- koduje endonuleazy, które wycinają T-DNA w obszarze LB. Vir C stymuluje proces przenoszenia T-DNA. Vir B- tworzą kanał transferowy przez który wnika T-DNA

Transformacje bezwektorowe Metody bezwektorowe nie wymagają użycia wektorów w postaci Agrobaterium tumefaciens czy A. rhizogenes Stosowane są do transformacji w tych przypadkach kiedy rośliny są niewrażliwe na agroinfekcje. Wadą transformacji bezwektorowej jest brak ochronny DNA dawcy przed uszkodzeniami i wprowadzenie wielu kopii transgenu do genomu biorcy. Niezbędnym etapem jest poddanie komórek roślinnych działaniu enzymu usuwającego ścianę komórkową. Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast, którego błona komórkowa stanowi koleją barierę dla transgenu, wprowadzanego do komórek z wykorzystaniem jednej z metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne.

Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych Fuzja liposomów-tworzone są liposomy, wewnątrz których są cząsteczki DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie -powstają wtedy "kuleczki" błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając do środka DNA Z użyciem PEG, chemiczna -polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego (PEG od ang. polyethylene glycol), który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez prowadzenia do niej chwilowej, odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wniknięcie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym Mikroiniekcja-polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco-i czasochłonna

PTP- polen tube pathawy Wykorzystuje naturalny proces wzrostu łagiewki pyłowej przez słupek do woreczka zalążkowego, w którym dochodzi do podwójnego zapłodnienia: jedno z jąder plemnikowych migrujących wraz z łagiewką zlewa się z komórką jajową, co prowadzi do powstania zygoty, a drugie ulega fuzji z jądrem komórki centralnej dając początek endospermie. Tą samą drogę może przebyć obcy DNA do zalążka, który będzie umieszczony na powierzchni słupka. W tym celu skraca się szyjkę słupka i usuwa znamię, a plazmidowy DNA umieszcza się bezpośrednio na odciętej powierzchni. W wyniku transformacji metodą PTP przeniesiono do bawełny odporność na chorobę grzybową; wprowadzono gen gna i cryl do pszenicy, które warunkują odporność na owady; u cyklamenu wprowadzono gen CHS z petunii – nowe barwy kwiatów.