Receptory metabotropowe Inna nazwa: G-protein coupled receptors = GPCRs Najliczniejsze odmiany receptorów Receptory „regulacyjne” - „brama” do biochemicznego i metabolicznego wnętrza komórki

5.22 A neurotransmitter can affect a postsynaptic cell via two types of receptor proteins. (Part 2) neuro3e-fig-05-22-2.jpg 2

Najważniejsze receptory metabotropowe Muskarynowe receptory acetylocholinowe Receptory adrenergiczne Receptory dopaminergiczne Receptory GABAB Metabotropowe receptory serotoninergiczne Metabotropowe receptory purynergiczne Metabotropowe receptory glutamatergiczne Receptory neuropeptydów (wszystkie są GPCRs) np. receptory enkefalin µ, δ, κ Receptory cannabinoidów (CB1, CB2)

Ogólny model receptora metabotropowego zewnątrzkomórki N Jest on homologiczny do rodopsyny. Pojedynczy polipeptyd (7 transbłonowych helikalnych segmentów.) Podobną budowę mają  adrenergiczne receptory oraz muskarynowe receptory cholinergiczne (mACh) Miejsce wiążące N-T w środku receptora (nie dotyczy to mGluR i GABAB oraz Rec. Neuropeptydowych). wewnątrzkomórki C

Sygnalizacja poprzez receptory sprzężone z białkiem G Białko G musi „wykryć” aktywację receptora! W zależności od typu białka G: Aktywacja (lub hamowanie) enzymu (jeden z czynników wzmacniających sygnał). - 1) cyklazy adenylowej: wytwarzanie (lub hamowanie) cAMP, ostatecznie aktywacja lub hamowanie kinazy białkowej PKA - 2) fosfolipazy C: tworzenie diacyloglicerolu (DAG) oraz IP3 – (IP3 uwalnia Ca2+ z magazynów śródkomórkowych), ostatecznie aktywacja kinazy białkowej PKC - 3) fosfolipazy A2: produkcja kw. Arachidonowego i jego metabolitów) - 4) cyklazy guanylowej: produkcja cGMP, ostatecznie: aktywacja kinazy białkowej PKG (cGMP działa głównie na kanały jonowe zależne od cyklicznych nukleotydów)

G-protein coupled receptors (GPCR = „metabotropowe”) Pomimo nazwy („metabotropowe”) GPCR poprzez aktywację białka G bardzo często modulują kanały jonowe a nie bezpośrednio „wpływają na metabolizm” Aktywacja białka G (GTP-binding protein) oznacza wymianę GDP w GTP Zaktywowane białko zmienia aktywność enzymów oraz kanałów jonowych. Powstają też „second messengers”

Szlaki transdukcji sygnału po aktywacji receptorów metabotropowych neuro3e-fig-07-06-0.jpg 7

Dysocjacja białka G po zaktywowaniu

Konwersja białka G do aktywnego stanu wiązania GTP „podmiana” GDP w GTP Stopień aktywności GTPazowej decyduje o charakterze danego typu białka G „AutoGTPazowa” hydroliza GTP

PKA = cAMP zależna kinaza proteinowa Dwie drogi sygnalizacji poprzez GPCRs: jedna „w kierunku” aktywacji PKA, druga PKC ew. Gi i fosfatydylocholina PLC = fosfolipaza C DAG = diacyloglicerol PKA = cAMP zależna kinaza proteinowa PIP2=dwufosforan fosfatydyloinozytolu CaM = kinaza zależna od kalmoduliny

PIP2 (DAG) pozosteje w błonie i aktywuje PKC neuro3e-fig-07-07-4.jpg Uwalnianie wapnia z zasobów wewnątrzkomórkowych (Ca jest tu „trzeciorzędowym” przekaźnikiem): 1. Receptor IP3 2. Receptor ryanodinowy* (m.in. w mięśniach - aktywowany depolaryzacją) (*ryanodine – roslinny alkaloid z tropikalnej rośliny Ryania speciosa używany w mieszankach jako insektycyd) 11

7.7 Neuronal second messengers. (Part 3) neuro3e-fig-07-07-3.jpg cAMP → PKA cGMP → PKG Inaktywacja cAMP przez cAMP fosfodiesterazę Inaktywacja cGMP przez cGMP fosfodiesterazę 12

Białka uczestniczące w regulacji poziomu wapnia w cytoplazmie: Uwaga na usuwające wapń z komórki: 1) Pompę Ca zużywającą ATP oraz 2) wymiennik Ca/Na neuro3e-fig-07-07-2.jpg 13

Fosfodiesteraza w transdukkcji sygnału w pręcikach siatkówki PDE-5 PDE-6 (rods) Rola fosfodiesteraz w mechanizmie skurczu/rozkurczu mięśnia

Sygnalizacja poprzez receptory sprzężone z białkiem G cAMP, Ca2+, diacyloglicerol aktywują kinazy proteinowe dla wielu różnych substratów (enzymy, kanały, białka strukturalne, czynniki transkrypcyjne). cAMP, cGMP, kwas arachidonowy i Ca2+ mogą też bezpośrednio otwierać i modulować kanały jonowe. Białka G mogą także bezpośrednio sprzęgać się z kanałami jonowymi (tzw G-protein gated ion channels) bez pośrednictwa „second messenger”

Cechy sygnalizacji poprzez receptory sprzężone z białkiem G Konkretny typ receptora może łączyć się w większości tylko z jednym rodzajem białka G Neuron ma tylko określony podzbiór GPCR i białek G Amplifikacja sygnału w układzie receptora typu GPCR: 1- zaktywowany receptor może aktywować wielokrotnie białko G 2- każda cyklaza adenylowa może zsyntetyzować wiele cAMP 3- każda kinaza proteinowa może ufosforylować wiele kopii swojego substratu „Orkiestracja” odpowiedzi komórkowej Ten sam wtórny przekaźnik może jednocześnie aktywować liczne i różne szlaki metaboliczne i aktywować transkrypcję genów (tzw. „orchestrated response”.)

7.2 Amplification in signal transduction pathways. neuro3e-fig-07-02-0.jpg 17

Duży zakres przestrzenny „Cross talk” Korzyści związane z sygnalizacją poprzez receptory sprzężone z białkiem G (w porównaniu z szybką transmisją) Amplifikacja sygnału Duży zakres czasowy Stosunkowo szybkie działanie poprzez modyfikację kanałów jonowych Wydłużone działanie gdy sygnał przenoszony jest na przekaźniki wtórne do sekund lub minut Duży zakres przestrzenny mogą wpływać m.in. na ekspresję genów „Cross talk” Składniki transdukcji sygnału i ich enzymatyczne efektory (np. kinazy) oddziałuja wzajemnie na siebie Skoordynowana modulacja („orkiestracja” różnych procesów)

Specyfika działania receptorów metabotropowych Komórki regulują wrażliwość na agonistę poprzez zmianę ilości receptora ! Desensytyzacja chroni system sygnalizacji przed saturacją. -(szybka desensytyzacja) przez fosforylację receptora - („wolna” desensytyzacja) przez endocytozę receptora

7.5 Types of GTP-binding protein. ras neuro3e-fig-07-05-0.jpg 20

Przegląd przykładowych receptorów metabotropowych dla różnych neurotransmiterów

Receptory muskarynowe ACh Dystrybucja: 1) W mózgu (dominująca rola w cholinergicznej neurotransmisji) 2) Komórki efektorowe unerwiane przez pozazwojowe neurony układu PARASYMPATYCZNEGO (i niektóre układu sympatycznego). Główny mechanizm: zmiana własciwości kanałów jonowych. Np. Kanał dla K+ w sercu, (przykład G-protein gated ion channel). gwałtownie wzmaga przepuszczalność w odpowiedzi na pojawienie się acetylocholiny działającej przez mAChR Ponadto aktywacja muskarynowego receptora Ach aktywuje hamujace białko G obniżające aktywność cyklazy adenylowej i spadek cAMP, w rezultacie osłabienie aktywności PKA i zmniejszenie fosforylacji kanałów wapniowych (osłąbienie przepuszczalności) (a propos: odruch oczno-sercowy) Antagonisci mACh: atropina, ipratropium

Receptory adrenergiczne Receptory dla noradrenaliny, adrenaliny (obie wiążą się do tego receptora)  aktywują cyklazę adenylową  hamują cyklazę adenylową. W mózgu głównymi receptorami adrenergicznymi są 2 i 1 Adrenergiczne receptory  i  są typowymi receptorami komórek docelowych unerwianych przez neurony pozazwojowe autonomicznego układu sympatycznego (z wyjątkiem gruczołów potowych i kom. Rdzenia nadnerczy).

Receptory adrenergiczne Różnice w dystrybucji receptorów adrenergicznych: 1 : mięśniówka większości naczyń krwion, mięsień rozszerzający źrenicę, mięśnie pilomotoryczne 2 : CSN, płytki krwi, zakończenia obwodowych nerwów adrenergicznych 1 : serce, CSN 2 : drogi oddechowe, macica, mięśnie części naczyń Skutki stymulacji adenergicznej zależą od rodzaju receptora.

Receptory adrenergiczne – punkt uchwytu wielu leków Agonistami receptorów R są adrenalina i noradrenalina – oraz fenylefryna Antagonistą receptorów R jest fentolamina (słabo wiąże też ) Agonistą receptorów  jest isoproterenol (izoprenalina) Antagonistą receptorów  jest propranolol (selekt. bloker 1 są metoprolol, atenolol) Wybiórczy agonista receptorów 2 – fenoterol, salbutamol

Receptory dopaminergiczne w corpus striatum 80% w korze mózgowej. 5 podtypów (DA1-DA5) D1 i D5 aktywuja cyklazę adenylową D2, D3 i D4 hamują cyklazę adenylową. Receptory dopaminergiczne wiążą (ale mało swoiście) różne leki jak bromokryptyna, haloperidol, klozapina

Receptor GABAB Obecne są w całym CSN, niekiedy kolokalizując z jonotropowymi receptorami GABAA. Receptory postsynaptyczne GABAB: działanie hamujące - tzw. „slow inhibitory postsynaptic potential” (powolna aktywacja przewodnictwa potasowego K+) Receptory presynaptyczne GABAB są elementem mechanizmu autorecepcyjnego (hamowanie uwalniania N-T poprzez aktywację kanałów K+ i hamowanie prądu wapniowego) Agonistą GABAB jest lek baclofen. Antagonistą GABAB jest phaclofen

Metabotropowe receptory serotoninowe: 5-HT(1,2,4,5) (Uwaga Metabotropowe receptory serotoninowe: 5-HT(1,2,4,5) (Uwaga! 5-HT3 jest jonotropowy) W mózgu: jądro szwu (n.raphae) w pniu mózgowym Dzielą się na podtypy 5-HT1,2,4,5 Receptory są sprzężone z cyklazą adenylową (pobudzając ją lub hamując) 5-HT bierze udział w modulacji rytmów dobowych, jedzenia, podwyższa ciśnienie krwi. Receptory 5-HT1A oraz 5-HT1B są głównie autoreceptorami i ich aktywacja w mechanizmie ujemnego sprzężenia zwrotnego hamuje uwalnianie serotoniny przez neurony raphe. Agoniści 5-HT1A oraz 5-HT1B obniżają lęk i agresję u myszy (wpływ na emocjonalne mechanizmy w których bierze udział serotonina). Z kolei myszy pozbawione tych receptorów są bardziej „lękliwe” i bardziej agresywne.

Metabotropowe receptory purynergiczne Wiążą ATP, inne analogi nykleotydów i adenozynę Receptory adenozynowe oznacza się nazwami: A1, A2a, A2b, A3 ich antagonistą jest kofeina Aktywacja receptora A1 (licznego w mózgu) hamuje cyklazę adenylową i powoduje wzrost fosfolipazy C. Pozostałe receptory również działają poprzez te enzymy ale w różny sposób Receptory ATP oznacza się literą: P2(x,y,z,t,u) (ale z nich P2x i P2z są jonotropowe) .

Glutaminergiczne receptory metabotropowe Typy mGluR Uwagi Antagoniści* Grupa I (mGluR1, mGluR5) aktywacja fosfolipazy C (wzrost IP3 i DAG), działają aktywująco MPEP (penetruje do mózgu, niekompetc.) Grupa II (mGluR2, -3) - zahamowaniem cyklazy adenylowej (spadek poziomu cAMP), działają hamująco, - także zahamowanie kanałów Ca2+ Bez znaczenia leczniczego Grupa III (mGluR4, -6, -7, -8) Mechanizm działania podobny do grupy II, zlokalizowane bliżej centrum synapsy niż recept.gr.II, Nie ma selekt. i penetr. do mózgu *Generalnie brak selektywnych agonistów i antagonistów dla mGluR.

Glutamatergiczne receptory metabotropowe typ I Receptory związane z białkiem G, aktywującym fosfolipazę C, Obecne są we wszystkich strukturach mózgu; Występują też pozamózgowo w automicznym ukł. nerwowym, w sercu, jelitach, kościach; Modulują aktywność neuronów i regulują uwalnianie GLU .

Receptory dla (neuro)peptydów Bardzo liczna rodzina – (żadne nie są kanałami jonowymi) Typu „metabotropowego” – (GPCRs) Lub Sprzęgnięte z kinazą tyrozynową Przykładowe receptory: Receptory opioidów (wszystkie metabotropowe): µ, δ, κ Przykłady leków działających poprzez receptory peptydowe: loperamid - agonista opioidowego receptora µ (lek przeciwbiegunkowy, podawany obwodowo może mieć także działanie przeciwbólowe?) trimebutina – (Debridat) nieswoisty agonista receptorów opioidowych - lek w zaburzeniach perystaltyki (pobudzając) w zespole jelita drażliwego loxiglumid – antagonista receptora CCK-A wywołuje uczucie głodu, może być też użyty w leczeniu refluksu (tzw. „GERD”)

Transdukcja sygnału z receptorów metabotropowych

Wtórne przekaźniki Bardzo istotne elementy sygnalizacji receptorów metabotropowych

Ważniejsze wtórne przekaźniki neuro3e-fig-07-07-1.jpg 35

cAMP-zależna kinaza białkowa (PKA) neurotransmisja poprzez aktywację adenylocyklazy i cAMP, fosforyluje reszty Ser/Tre Regulacja ekspresji genów poprzez [cAMP response element-building protein] = CREB Regulacja syntezy katecholamin (poprzez hydrolazę tyrozyny) Regulacja MAP-2 (microtubule associated protein) Regulacja przewodnictwa błonowego (kanały K+) Regulacja czułości receptora AMPA PKA 4 molekuły cAMP Tetramer

Ca2+-Kalmodulinozależna kinaza białkowa: Wielofunkcyjna kinaza białkowa CaMII dekoduje wszelkie sygnały które podwyższają poziom Ca2+ Fosforyluje hydrolazę tyrozyny, MAP-2, synapsin, kanały wapniowe, receptory glutaminianowe, Ca2+-ATPase, czynniki transkrypcyjne, Kinaza CaMII jest aktywowana wapniem niezależnie od jego źródła Jest szczególnie obfita w neuronach (nawet 2% wszystkich protein w hipokampie tj. 50x więcej niż w innych tkankach ) Autofosforylacja jest jedną z najistotniejszych cech CaMII. Powoduje 400x wzrost powinowactwa do kalmoduliny i w efekcie aktywność CaMII trwa wiele sekund po spadku poziomu wapnia !

PKC (kinaza proteinowa C) (główny cel systemu sygnałowego PI) PKC to kolektywna nazwa dla rodziny kinaz łączących się z sygnalizacją przez PI i fosforylujących reszty Ser/Thr PKC aktywowana przez diacyloglicerol (DAG) i Ca2+. Kinazy PKC są monomerami „kotwiczone” do różnych miejsc przez tzw. anchoring proteins Do jej substratów należą liczne białka regulacyjne cyklu i wzrostu komórki oraz m.in. kanałów jonowych i receptorów takich jak NMDA i AMPA W nowotworach PKC jest stymulowana nietypowo przez estry forbolu (promotory nowotworowe), które symulują działanie DAG.

PKA, PKC, CaMKII są tzw. „ kinazami kognitywnymi” PKA, PKC, CaMKII podlegają trwałym zmianom aktywności nie ustępującym nawet po zaniknięciu stymulującego je sygnału (wtórnego przekaźnika) Kinazy te modulują aktywność synaptyczną Jest to rodzaj „pamięci” zdarzenia, jakim była długotrwała impulsacja serotoninergiczna PKA Po długiej stymulacji np. serotoninergicznej aktywne pojednostki C dostają się do jądra gdzie stymulują syntezę genów proteinaz (fosforylacja CREB) dla podjednostki R co powoduje trwałe wydłużenie aktywności PKA

Transkrypcja genów zależna od aktywacji receptorów metabotropowych Rola czynników transkrypcyjnych CREB (cAMP response element-binding) Czynniki transkrypcyjne trwale związane z elementami regulacyjnymi genów. Rozsiane sekwencje regulatorowe genu rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne

Czynnik transkrypcyjny CREB (dimery) aktywowany przez aktywną podjednostkę PKA, Czynniki transkrypcyjne takie jak np. CREB -trwale związane z regulacyjnymi cis-elementami DNA - CRE (cAMP response elements) i obecne w wielu genach CRE maja sekwencję palindromiczą typu: TGACGTCA ACTGCAGT

Receptory z aktywnością kinazy tyrozynowej – kolejni ważni gracze w sygnalizacji – partnerzy innych receprtorów

PKTyr (Tyrozynowa kinaza proteinowa) Dwie klasy PKT 1) receptorowe (błonowe) 2) cytoplazmatyczne Receptorowe PKT – transdukcja licznych czynników wzrostu, regulacja cyklu oraz różnicowanie komórki Cytoplazmatyczne PKT- te same procesy lecz bez udziału receptora Znaczenie: - fosforylacja tylko tyrozyny (mniejsze prawdopodobieństwo „błędnej” (przypadkowej) proteiny. fosfotyrozyna wywołuje znacznie większe zmiany konformacyjne białka niż fosforylacja Ser/Thr Stężenie kinaz tyrozynowych i ich substratów jest znacznie mniejsze w stosunku do pozostałych kinaz.

Aktywacja ekspresji genów poprzez CREB: możliwość KONWERGENCJI sygnału NMDAR, L-VGCC neuro3e-fig-07-11-0.jpg 44

Dodatek Receptory z aktywnością kinazy tyrozynowej i ich znaczenie w medycynie

Hamowanie receptora c-KIT kinazy tyrozynowej jest wykorzystywane w leczeniu nowotworów: przewlekłe białaczki nowotwory stromalne („zrębowe”) przewodu pokarmowego – lek: imatinib Złośliwych glejaków

Znaczna część GBM wykazuje amplifikację receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) mającego cechy PKTyr ponadto w części przypadków pojawia się konstytutywnie zaktywowany zmutowany wariant EGFRvIII.

panitumumab lapatinib Loew s. et. Al.. The Epidermal Growth Factor Receptor as a Therapeutic Target in Glioblastoma Multiforme and other Malignant Neoplasms Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2009, 9, 703-715

Aspekty medyczne: Ekscytotoksyczność Uszkodzenie/śmierć komórek na skutek nadmiernego pobudzenia spowodowanego glutaminianem (główny nurotransmiter pobudzający) Zasadnicza rola receptorów NMDA (przepuszczających m.in. Jony wapnia) Jony wapnia wnikające w nadmiarze do komórki aktywują enzymy (fosfolipazy, proteazy, endonukleazy) uszkadzające i niszczące komórkę. Liczne schorzenia, w których stwierdzono lub podejrzewa się istotną rolę mechanizmów ekscytotoksycznych

Schorzenia, w których stwierdzono lub podejrzewa się istotną rolę mechanizmów ekscytotoksycznych Udar (niedokrwienie) mózgu Otępienie naczyniopochodne (multi-infarct) Uraz mechaniczny mózgu i rdzenia Padaczka (zwł status epilepticus) Choroby zwyrodnieniowe ch. Alzheimera, ch. Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), pląsawica Huntingtona Rasmussen encephalitis Stwardnienie rozsiane Schizofrenia

Glutaminian jako smakołyk Umami – nazwa smaku nadana przez Ikeda – związana z monosodium glutamate Kwas glutaminowy odkryty w wywarze z wodorostów (brunatnic) morskich zw. Kombu przez prof. Ikeda z Uniw. W Tokio 1907, Ikeda opatentował wytwarzanie monosodium glutamate (MSG, glutaminian jednosodowy) jako „usmaczniacza”

GLU w niedokrwieniu (niedotlenieniu) Czynnikiem uwalniającym GLU może być: utrata zasobów energetycznych przez komórki, spadek produkcji ATP w mitochondriach ? zaburzenie działania pomp jonowych Wzrost GLU pozakomórkowego Aktywacja receptorów Napływ jonów Ca2+ do komórek Aktywacja syntazy NO i innych enzymów (fosfolipaza A2) Wzrost wolnych rodników

GLU 100-500 mikromoli/L prowadzi do martwicy w hodowli neuronów GLU 20 mikromoli/L prowadzi do ich apoptozy Eksperymentalny bloker NMDA MK-801 (dizocilpine) zmniejsza uszkodzenie poischemiczne, pohipoglikemiczne i pourazowe Podobne działanie (i mechanizm) ma nimodypina Niestety, blokery receptorów GLU mają działania uboczne (represja normalnej neurotransmisji)

Stwardnienie boczne zanikowe (ALS, chor. Lou Gherig) W części przypadków ALS opisano zaburzenia białek transporterowych EAAT1-2 Wykazano przy pomocy spektroskopii MRI wzrost GLU+GLN w opuszce chorych na ALS Riluzol (Rilutek) – lek blokujący uwalnianie GLU wydłuża przeżycie chorych z SLA

Rasmussen encephalitis Stwierdzono obecność przeciwciał z krwi obwodowej przeciwko podjednostce GluR3 receptora AMPA co ma prowadzić do uszkodzenie ekscytotoksycznego neuronów kory mózgu (Rogers SW i wsp. Science 265, 648-651, 1994; He XP i wsp. Neuron, 20, 153-163, 1998) Stwierdzono również obecność p-ciał przeciw białku synaptycznemu Munc-18 co prowadzi do zaburzonego przewodnictwa (Yang R i wsp. Neuron, 28, 375-383, 2000)

Zapalenie mózgu Rasmussena: autoagresja przeciw receptorowi GluR-3 ? Opis typowego przypadku: Dziewczynka - Padaczka od 3 r.ż Niedowład Obniżone cechy intelektualne (ale chodzi do szkoły) Cechy zaniku półkuli Obecnie - przebieg 13 lat Neuropatologia: „typowe” zmiany patologiczne mózgu, takie jak nacieki limfocytarne i grudki mikroglejowe itp. Lecz także z cechami zaburzeń budowy kory (MCD)