BIAŁKA W DIAGNOSTYCE LABORATORYJNEJ Karolina Słapek Gr. A/B III OAM

Białka związki zbudowane z aminokwasów (min Białka związki zbudowane z aminokwasów (min. 100) połączonych wiązaniem peptydowym -CONH-

FUNKCJE BIAŁEK katalityczna – enzymy strukturalna – np. kolagen, elastyna, keratyna ochronna – immunoglobuliny skurcz – aktyna, miozyna transport – albumina (kw. tłuszczowe), hemoglobina (tlen), transferyna (żelazo) regulacja hormonalna – insulina regulacja genowa - histony

BIAŁKA W DIAGNOSTYCE LABORATORYJNEJ OSOCZE/SUROWICA MOCZ PMR

OSOCZE/SUROWICA Rola białek osocza: dystrybucja płynów krew/przestrzeń pozakomórkowa hemostaza i koagulacja funkcje transportowe (nośniki hormonów, metabolitów, metali, leków) enzymy, regulatory białka ukł. odpornościowego składniki ukł. buforowego hormony i receptory składniki ukł. tkanki łącznej materiał odżywczy

OSOCZE/SUROWICA Powstawanie białek: albumina – wątroba immunoglobuliny – limfocyty hormony, enzymy, apoproteiny – różne narządy Utrata białek: katabolizowane w wątrobie albuminy – rozkład w skórze trawienie w przewodzie pokarmowym (5g/dobę) filtracja nerkowa (20-80mg białka, w tym nie więcej niż 30mg albuminy; większość resorbowana)

OSOCZE/SUROWICA Stężenie białka całkowitego w osoczu w warunkach prawidłowych wynosi 66-87g/l (w surowicy – brak fibrynogenu – wynosi 65-82g/l).

OSOCZE/SUROWICA Prawidłowy poziom białka całkowitego zależy głównie od równowagi między syntezą i degradacją dwóch głównych frakcji białkowych: albumin i immunoglobulin. Inne frakcje białka nie wpływają znacząco na poziom białka całkowitego.

OSOCZE/SUROWICA Hipoproteinemie: obniżenie poziomu białek w wyniku utraty białek, zahamowania ich syntezy lub rozcieńczenia krwi główną przyczyną jest zmniejszenie stężenia albuminy w łożysku naczyniowym (rzadko niedobór immunoglobulin) obniżenie wartości stosunku albumina/globulina obserwujemy w: marskości wątroby zespole nerczycowym niektórych chorobach infekcyjnych szpiczaku mnogim

OSOCZE/SUROWICA Hiperproteinemie: powstają w wyniku zwiększonej produkcji jednej lub wielu klas Ig zwiększeniu stężenia immunoglobulin często towarzyszy obniżenie poziomu albuminy hiperproteinemia z hiperalbuminemią mogą być wywołane odwodnieniem lub artefaktem (zbyt długo zaciśnięta staza)

OSOCZE/SUROWICA Przyczyny hiperproteinemi: —hipergammaglobulinemie monoklonalne szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenströma, nowotwory układu chłonnego, hipergammaglobulinemie poliklonalne przewlekłe stany zapalne, choroby autoimmunologiczne, przewlekłe choroby wątroby marskość, wirusowe zapalenia, błędy w pobieraniu krwi

OSOCZE/SUROWICA Odczyn Biernackiego a białka osocza? Szybkość OB jest wypadkową składu osocza oraz właściwości erytrocytów. Zwiększenie stężenia fibrynogenu, białek ostrej fazy oraz spadek stężenia albuminy powodują wzrost OB.

OSOCZE/SUROWICA Prawidłowy skład frakcji białkowych surowicy w rozdziale elektroforetycznym FRAKCJA % BIAŁKA albuminy 55.0 – 70.0 albumina α1 1.1 – 4.2 α1-antytrypsyna, α1-kw. glikoproteina, α-lipoproteina α2 4.4 – 13.0 α2-makroglobulina, haptoglobina β 7.3 – 13.5 transferyna, β-lipoproteina, frakcja C3 dopełniacza γ 8.1 – 19.9 Immunoglobuliny, białko C-reaktywne

OSOCZE/SUROWICA Elektroforeza białek surowicy Polega na rozdziale białek surowicy w polu elektrycznym na różnego rodzaju podłożach w buforze o zasadowym pH. W tych warunkach większość białek jest anionami i wędruje w kierunku anody (zwłaszcza białka mniejsze – albuminy i α- globuliny).

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA Albumina: prawidłowa zawartość – 40-52g/l synteza w wątrobie, rozkład w skórze bisalbuminemia analbuminemia niespecyficzny system transportowy (hormony, witaminy, Ca, Mg, kw. tłuszczowe, leki, bilirubina, lipidy)

OSOCZE/SUROWICA Białka ostrej fazy: grupa białek syntetyzowanych w wątrobie, których poziom wzrasta w przebiegu stanów zapalnych, chorób zakaźnych, urazów, nowotworów oraz procesów martwiczych czynniki aktywujące syntezę białek: produkty rozpadu uszkodzonych tkanek, cytokiny zaliczamy: α1-antytrypsynę (AAT) α1-kwaśną glikoproteinę (AAG) haptoglobinę ceruloplazminę (CER) fibrynogen białko C-reaktywne

OSOCZE/SUROWICA Ujemne białka ostrej fazy: — Albumina — Transferryna — Prealbumina Dodatnie białka ostrej fazy: — fibrynogen — α1- antytrypsyna (AAT) — ceruloplazmina — haptoglobina (HP) — białko C-reaktywne (CRP) — surowicze amyloidowe białko A (SAA) — laktoferryna — białka układu dopełniacza

OSOCZE/SUROWICA α1-antytrypsyna – inhibitor proteaz; inhibicja elastazy uwalnianej podczas fagocytozy przez granulocyty wielojądrzaste; α1-glikoproteina – odpowiada za wiązanie i transport progesteronu; wzrost w stanach zapalnych, spadek w ciężkich uszkodzeniach wątroby; haptoglobina – odpowiada za wiązanie i transport Hb pozakrwinkowej; ceruloplazmina – katalizuje utlenianie Fe2+ do Fe3+ fibrynogen – ważne białko układu krzepnięcia białko C-reaktywne – jego poziom wzrasta w zakażeniach bakteryjnych, rozległych urazach, chorobach nowotworowych, oparzeniach oraz martwicach narządowych; α2-makroblobulina – drugi po AAT inhibitor proteaz takich jak trypsyna, chymotrypsyna, trombina, plazmina i kalikreina; transferyna – transportuje jony Fe3+ do szpiku kostnego; białka układu dopełniacza – zespół ok. 20 różnych białek; jego działanie polega na aktywacji kaskady enzymatycznej, doprowadzającej do szeregu zjawisk mających istotne znaczenie w przebiegu odpowiedzi immunologicznej i reakcji zapalnej.

OSOCZE/SUROWICA Immunoglobuliny: syntetyzowane przez limfocyty B mają zdolność do swoistego rozpoznawania antygenu

OSOCZE/SUROWICA IgG – główne przeciwciała wtórnej odpowiedzi centralnego systemu odpornościowego IgD – mało poznane przeciwciała receptorowe występujące na powierzchni limfocytów B IgE – wysoko cytofilne przeciwciała alergicznej odpowiedzi typu 1 (alergia anafilaktyczna); występują w krążeniu w niewielkiej ilości, opłaszczone są gł. na bazofilach i mastocytach IgA – występują w 2 podklasach: IgA1 – niewielka grupa przeciwciał monomerycznych występujących w krążeniu IgA2 – przeciwciała dimeryczne; uczestniczą w we wtórnej odpowiedzi śluzówkowej systemu MALT IgM – główne przeciwciała pierwotnej fazy odpowiedzi humoralnej; są pentamerami (rzadziej heksamerami)

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA Hipogammaglobulinemie: nabyte: nowotwory układu chłonnego po usunięciu śledziony jelitowe i nerkowe zespoły utraty białka leczenie cytostatykami lub promieniowaniem jonizującym niedokrwistość złośliwa, hemoglobinopatie zaburzenia dojrzewania immunoglobulin u dzieci

OSOCZE/SUROWICA Wrodzone izolowane niedobory IgA lub IgM agammaglobulinemia związana z płcią (chłopcy – wszystkie Ig ↓↓) kombinowany zespół niedoboru immunologicznego (IgG ↓, limfopenia, deaminaza adenozyny ↓) niedobór przeciwciał z niezbornością naczyniakową niedobór immunologiczny z trombocytopenią

OSOCZE/SUROWICA Hipergammaglobulinemia: reakcja organizmu na różnego typu zakażenia odpowiedź poliklonalna – Ag mikroorganizmów powodują stymulację licznych linii limfocytarnych ostre stany zapalne ostre WZW marskość wątroby AIDS odpowiedź monoklonalna – w wyniku chorób nowotworowych ukł. chłonnego dochodzi do rozrostu pojedynczych linii limfocytów B przewlekłe białaczki limfatyczne szpiczaki chłoniaki

MOCZ W warunkach fizjologicznych nerki wydalają niewielką ilość białka – do 150mg/24h. Podwyższona ilość białka pojawia się najczęściej w chorobach nerek przy zwiększonej przepuszczalności kłębuszków nerkowych. Mikroalbuminuria to zwiększone wydalanie albumin (powyżej 30mg/24h) przy nie ujawniającym się białku w moczu. Służy do wczesnego wykrywania nefropatii.

MOCZ Rodzaje białkomoczu Rodzaj białkomoczu Ilość białka prawidłowy <150mg/24h znikomy <500mg/24h mierny 0.5 – 3.5g/24h masywny >3.5g/24h

MOCZ Rodzaje białkomoczu: przednerkowy kłębkowy kanalikowy pozanerkowy gammapatie monoklonalne zespoły hemolityczne mioglobinemie kłębkowy kłębkowe zapalenie nerek (dzieci) nadciśnienie kanalikowy przeszczepy nerek choroby układowe pozanerkowy zapalenie dróg moczowych nowotwory uszkodzenia mechaniczne

PMR Białko całkowite w PMR wynosi 0,15 – 0,45g/l, z czego 80% pochodzi z surowicy a 20% powstaje lokalnie w przestrzeni wewnątrzczaszkowej.

PMR Badanie elektroforetyczne PMR ma duże znaczenie w diagnostyce stanów zapalnych mózgu oraz przy zaburzeniach przepuszczalności ścian splotu naczyniowego. Przed rozdziałem elektroforetycznym PMR musi być 100-200-krotnie zagęszczony!

PMR Prawidłowy obraz elektroforetyczny PMR: obecne wszystkie frakcje występujące w surowicy duża zawartość β-globulin zmniejszona zawartość γ-globulin frakcja V-prealbuminy oraz frakcja τ znajdują się między β i γ-globulinami brak fibrynogenu

PMR Głównym celem badań poziomu białka całkowitego i białek specyficznych jest ocena przepuszczalności bariery krew- PMR oraz wykrywanie wewnątrzpłynowej syntezy immunoglobulin.

PMR I = albumina PMR(mg/dl)/albumina surowica(g/dl) ~<9 I<9 – prawidłowa bariera krew-PMR I=9-14 – lekkie upośledzenie I=14-30 – umiarkowane upośledzenie I=30-100 – poważne upośledzenie I>100 – całkowite załamanie bariery

I=IgG PMR/albumina PMR ~<0.27 Wartość współczynnika wyższa niż 0.27 wskazuje na wewnątrzpłynową syntezę IgG.

PMR Wskaźnik Linka i Tiblinga I= [IgG PMR/IgGsur]/[Alb PMR/Albsur] ~<0.7 IgG PMR – stężenie IgG w PMR IgGsur - stężenie IgG w surowicy Alb PMR – stężenie albuminy w PMR Albsur– stężenie albuminy w surowicy Wartości wyższe niż 0,7 świadczą o syntezie IgG w PMR.

METODY OZNACZANIA BIAŁEK Metoda biuretowa Metoda Lowry’ego (Folin-Ciocalteu) Metoda z użyciem kwasu bis- cynchoninowego Metoda Bradforda Absorbancja w nadfiolecie Metoda nefelometryczna Metoda turbidymetryczna

METODY OZNACZANIA BIAŁEK Metoda biuretowa Odczynniki: CuSO4, winian sodowo-potasowy, NaOH, KI Pomiar absorbancji: 540nm Zakres liniowości metody: 2-15g/l Zasada metody: reakcja jonów Cu2+ z wiązaniem peptydowym Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w surowicy

METODY OZNACZANIA BIAŁEK Metoda Lowry’ego Odczynniki: CuSO4, winian sodowo-potasowy, NaOH, Na2CO3, odczynnik Folin-Ciocalteu Pomiar absorbancji: 750nm Zakres liniowości metody: 10mg/l-1g/l Zasada metody: 1) reakcja aminokwasów z odczynnikiem Folina 2) reakcja biuretowa Materiał: mocz, PMR

METODY OZNACZANIA BIAŁEK Metoda z użyciem kwasu bis-cynchoninowego (BCA) Odczynniki: Na2CO3, NaOH, winian sodowy, CuSO4, BCA Pomiar absorbancji: 562nm Zakres liniowości metody: 0.1-1g/l (mikrometoda) lub 0.5-10mg/l (makrometoda) Zasada metody: w alkalicznym środowisku niektóre składniki białek (tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna) redukują jony Cu2+ do Cu1+ (które tworzą barwny kompleks z BCA)

METODY OZNACZANIA BIAŁEK Metoda Bradforda Odczynniki: Coommassie Brillant Blue G-250 (CBB G250), 95% etanol, 85% kwas fosforowy Pomiar absorbancji: 595nm Zakres liniowości metody: 1-10μg (mikrometoda) lub 10-100μg (makrometoda) Zasada metody: w metodzie wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika błękitu brylantowego - CBB G250 z grupami aminowymi białek.

METODY OZNACZANIA BIAŁEK Absorbancja w nadfiolecie Pomiar absorbancji roztworu białka przy dł. fali 280nm Metoda używana do oszacowania stężenia białka.

METODY OZNACZANIA BIAŁEK Metoda nefelometryczna Polega na pomiarze natężenia światła rozproszonego pod kątem różnym od 180 stopni w stosunku do kąta padania światła. Nie nadaje się do oznaczeń w roztworach wstępnie mętnych.

METODY OZNACZANIA BIAŁEK Metoda turbidymetryczna Odczynniki: kwas trichlorooctowy (TCA), kwas sulfosalicylowy, chlorek benzetonium, NaOH Zakres liniowości metody: 2-200mg/dl Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w moczu i PMR

Dziękuję za uwagę