Metody badań strukturalnych w biotechnologii Wykład VII Spektroskopia elektronowa (UV-Vis) Spektroskopia CD

Przejście elektronów w cząsteczce ze stanu podstawowego do wzbudzonego powoduje zmiany energii oscylacyjnej i rotacyjnej. Widma UV-Vis są zatem widmami elektronowo-rotacyjno-oscylacyjnymi i dlatego jest to dobre narzędzie do badania struktury cząsteczki

Spektroskopia elektronowa znajduje zastosowanie: Identyfikacja związków organicznych, Badanie struktury kompleksów tworzonych przez metale przejściowe, Badania kinetyczne (np. równowagi kwasowo/zasadowe i wykrywanie pośrednich produktów reakcji)

Zakres widzialny 380nm < violet < 450nm 455nm < blue < 485nm 500nm < green < 550nm 570nm < yellow < 590nm 625 nm < red

Schemat spektrofotometru UV-Vis

Przejście σ→σ*

Przejście π→π*

Przejście n→π*

Widmo elektronowe Absorbance . Absorbance Długość fali , podawana w nanometerach (nm) 0.0 400 800 1.0 200 maxdla charakterystycznej  UV Visible

Rozpuszczalniki stosowane w spektroskopii UV-Vis Woda 205 CH3CN 210 C6H12 210 Eter 210 EtOH 210 Heksan 210 MeOH 210 Dioksan 220 THF 220 CH2Cl2 235 CHCl3 245 CCl4 265 Benzen 280 Aceton 300

Zależność między transmittancją a absorbancją Transmitancja: T = P/P0 P0 P Absorbancja: A = -log T = log P0/P B (długość drogi optycznej) Zależność między transmittancją a absorbancją

Parametry charakteryzujące widmo elektronowe to intensywność absorpcji promieniowania, a w szczególności molowy współczynnik absorpcji ε, określony przez prawo Lamberta-Beera: A = εbc gdzie: A – absorbancja, b – grubość kuwety (cm), c – stężenie molowe roztworu

Dlaczego zastosowanie prawa Lamberta-Beera wymaga użycia absorbancji zamiast transmitancji? Prawo przestaje mieć zastosowanie wraz ze wzrostem stężenia

Podstawowe pojęcia w spektroskopii UV-Vis: chromofor Grupa odpowiedzialna za absorpcje i tym samym za nadawanie barwy (np C=C, C=O) auksochrom Grupa, ktora przyłączona do chromoforu zmienia intensywność i położenie pasma absorpcji (np -OH, -Cl) Przesunięcie batochromłowe Przesunięcie pasma w kierunku mniejszych częstości (większych długości fali) Przesunięcie hipsochromowe Przesunięcie pasma w kierunku większych częstości (mniejszych długości fali)

Efekt hiperchromowy Zwiększenie intensywności pasma pod wpływem podstawnika, rozpuszczalnika czy oddziaływania Efekt hipochromowy Zmniejszenie intensywności pasma pod wpływem podstawnika, rozpuszczalnika lub oddziaływania

Podobne struktury mają zbliżone widma elektronowe: λmax = 238nm λmax = 240nm λmax = 173nm

σ→σ* 135nm π→π* 165nm n→σ* 183nm π→π* 150nm n→σ* 188nm n→π* 279nm

Azulen λmax (nm) = 696 ε = 150

Pasma absorpcji odpowiadające przejściom π→π*

Widma elektronowe peptydu w zależności od jego konformacji w roztworze: 1 – α-helisa, 2 – konformacja nieuporządkowana, 3 –β-zgięcie

Zastosowanie przejscia π→π Zastosowanie przejscia π→π* (Soret band) w badaniach strukturalnych porfiryn

Orbitale d w polu o symetrii oktaedrycznej

CD (Circular Dichroism) – spektroskopia dichroizmu kołowego Metoda badania budowy przestrzennej związków chiralnych przy użyciu światła spolaryzowanego Warunkiem niezbędnym do wykonania eksperymentu jest absorpcja promieniowania i występowanie centrum chiralności w badanym układzie.

Δε = εL - εR Niejednakowa absorpcja prawego i lewego, kołowo spolaryzowanego promieniowania nazywa się dichroizmem kołowym. Miarą jego wielkości Jest współczynnik Δε, który wyraża różnicę współczynników molowych absorpcji lewego i prawego, kołowo spolaryzowanego promieniowania: Δε = εL - εR

Zastosowania spektroskopii CD: badania konformacyjne peptydów i białek, badanie geometrii układów koodrynacyjnych

Zależność pomiędzy typem konformacji, a kształtem widm CD dla peptydów i białek antiparallel b-sheet b-turn a-helix other

Różne białka dają różne widma CD – jest to efekt równowagi pomiędzy chymotrypsin lysozyme triosephosphate isomerase myoglobin Różne białka dają różne widma CD – jest to efekt równowagi pomiędzy różnymi formami konformacyjnymi helix 78 52 36 10 sheet 14 9 34 turn 12 11 32 20 other 23 protein myo TIM lys chym percent content

Zmiany obserwowane na widmie CD pozwalają śledzić różne procesy np. denaturację peptydów i białek 21ºC : a nice a-helical signal 81ºC : a coil-like signal