http://biolmolgen.slam.katowice.pl WYKŁAD 1/2 WZROST WZROST WZROST

MEJOZA CYKL KOMÓRKOWY APOPTOZA FAZY CYKLU SZLAKI REGULATORY CYKLU AKTYWATORY BLOKERY APOPTOZA SZLAKI MEJOZA A.L. SIEROŃ

ŚMIERĆ KOMÓRKI I APOPTOZA Śmierć komórek następuje przez jeden z dwóch mechanizmów: 1. NEKROZĘ - następującą w wyniku działania uszkadzających czynników zewnętrznych np.: ciężkie oparzenia urazy mechaniczne 2. APOPTOZĘ - czyli zaprogramowaną śmierć komórek - będącą wynikiem następujących kolejno po sobie reakcji na bodźce biochemiczne lub fizyczne.

APOPTOZA Jest złożonym sposobem pozbywania się przez organizm niechcianych lub uszkodzonych komórek. Jest zaangażowana w homeostazę tkanek i różnicowanie komórek. Większość komórek organizmu ma z góry określoną długość życia. Śmierć komórki jest normalnie, ściśle regulowanym procesem, w którym komórki nieustannie odpowiadają na sygnały chemiczne pochodzące od innych komórek lub ze swojego otoczenia.

APOPTOZA jest bezpośrednio zaangażowana w degeneracji; np. choroby: Alzheimera, Huntigtona, Parkinsonizm. w autoimmunoagresji: odczyny reumatyczne w choroby wirusowe: AIDS w przemianach nowotworowych

S T A R T Apoptoza zaczyna się w komórkach nie dających się naprawić, lub które zakończyły swoją zaprogramowaną funkcję biologiczną. Inna morfologia komórek wynika z zaburzeń w budowie błon komórkowych.

WYKŁAD 1 cz. 2 (BIOLOGIA I BIOLOGIA Z GENETYKĄ; KIERUNKI: LEKARSKI, III ROK) CYKL KOMÓRKOWY FAZY CYKLU REGULATORY CYKLU AKTYWATORY BLOKERY APOPTOZA GRACZE SZLAKI MEJOZA A.L. SIEROŃ

GRACZE W APOPTOZIE

DOMENA ZEWNĄTRZ KOMÓRKOWA Complex DOMENA BŁONOWA DOMENA ZEWNĄTRZ KOMÓRKOWA CYTOPLAZMATYCZNA DOMENA

Complex ZEWNĄTRZ CYTOPLAZMA

WYKŁAD 1 cz. 2 (BIOLOGIA I BIOLOGIA Z GENETYKĄ; KIERUNKI: LEKARSKI, III ROK) CYKL KOMÓRKOWY FAZY CYKLU REGULATORY CYKLU AKTYWATORY BLOKERY APOPTOZA GRACZE SZLAKI MEJOZA A.L. SIEROŃ

SZLAKI APOPTOZY RECEPTOROWY A P O P T O Z A MITOCHONDRIALNY

Szlak mitochondrialny Szlak receptorowy FasL Domena zewnątrz-komórkowa Fas/CD95 Błona komórkowa Szlak mitochondrialny pro--Bid cytochrom c kaspaz-9/cytochrom c Kaspazy wykonawcze & inne substraty mitochondria p15tBid FADD pro-kaspaza-8

ODCZYNY ZAPALNE (NEKROZA) (Cys-Proteazy) ODCZYNY ZAPALNE (NEKROZA) A P O P T O Z A

A P O P T O Z A GRACZE W APOPTOZIE ODCZYNY ZAPALNE (NEKROZA) Szlak mitochondrialny Szlak receptorowy ODCZYNY ZAPALNE (NEKROZA) A P O P T O Z A

Po przyłączeniu ligandu (np..: Fas) Szlak receptorowy Domena zewnątrz-komórkowa FasL Fas/CD95 Błona komórkowa Po przyłączeniu ligandu (np..: Fas) Szlak mitochondrialny FADD cytochrom c kaspaza-9/cytochrom c Kaspazy wykonawcze & inne substraty mitochondria p15tBid pro--Bid pro-kaspaza-8 pro-kaspaza-8 kaspaza 8

Szlak mitochondrialny Szlak receptorowy pro-kaspaza-8 pro--Bid kaspaza 8 cytochrom c kaspaza-9/cytochrom c mitochondria p15tBid Domena zewnątrz-komórkowa FasL Fas/CD95 Błona komórkowa FADD Szlak mitochondrialny kaspaza 3 Kaspazy wykonawcze & inne substraty

MUTACJE NIEAKTYWNE LIGANDY pro-kaspaza-8 Domena zewnątrz-komórkowa FasL Fas/CD95 Błona komórkowa FADD Jądro komórkowe Bcl2 MUTACJE NIEAKTYWNA KASPAZA 8 MUTACJE NIEAKTYWNE RECEPTORY p53 Bax MUTACJE NIEAKTYWNE KINAZY Kaspazy wykonawcze & inne substraty kaspaza 3 cytochrom c kaspaz-9/cytochrom c p15tBid mitochondria

Rycina 6 Model wpływu Bcl-xS w fibroblastach zarodków mysich (MEFs). Lindenboim L., et al. Cell Death and Differentiation (2005) 12, 713–723 Rycina 6 Model wpływu Bcl-xS w fibroblastach zarodków mysich (MEFs). Ekspresja Bcl-xS w MEFs wzbudza ekspozycję N-końca (NT) Bak, co prowadzi do aktywacji Bak. Zaktywowany Bak może indukować as trzy ścieżki sygnałowe: główna ścieżka prowadzi do uwolnienia cytochromu c, który aktywuje apoptosom i nastepczą śmierć komórki na drodze zależnej od kaspaz; druga ścieżka, prowadzi do Apaf-1- i niezależnej od kaspazy-9 śmierci komórkie; a trzecia ścieżka wzbudza ekspozycję NT Nax aktywując go na obydwu drogach zależnej- i niezależnej od caspazy-9. Pierwsze dwie ścieżki mają udział w procesach śmierci. Znaczenie trzeciej ścieżki jest dotychczas słabo poznane.

PRZEBIEG APOPTOZY W jądrze komórkowym („mózgu” komórki) chromatyna ulega zagęsz-czeniu, a DNA fragmentacji. Komórka w apoptozie jest otaczana przez sąsiadujące normalne komór-ki, które pochłaniają jej fragmenty i zużywają je na własne potrzeby.

Główne ścieżki prowadzące do śmierci kaspozo -zależnej i –niezależnej Główne ścieżki prowadzące do śmierci kaspozo -zależnej i –niezależnej. Zidentyfikowano dwie ścieżki apoptotyczne kaspazo-zależne: ścieżkę zewnętrzną pobudzaną przez czynniki należące do nadrodziny typu receptora TNF-NGF (czynnik wzrostu nerwu), takie jak receptor TNF (TNFR), CD95 (Fas)-APO-1 receptor lub receptor typu TRAIL (‘receptory śmierci’) oraz ścieżkę wewnętrzną z udziałem MOMP prowadzącym do formowania kompleksów aktywujących kaspazy pomiędzy kaspazą 9 i Apaf-1 (apoptosom). Pobudzenie receptora śmierci prowadzi zwykle do rekrutacji i aktywacji kaspazy 8 za pośrednictwem białek adaptorowych FADD i TRADD, tworzących DISC, który rozprzestrzenia sygnał śmierci dwiema drogami: przez proteolizę białka BH3-only protein Bid, co wywołuje przemieszczenie tego ostatniego do mitochondrium i MOMP oraz przez bezpośrednią proteolizę następnych kaspaz, która powoduje ich aktywację. Na ścieżce wewnętrznej białka BH3-only działają tylko w odpowiedzi na stres komórkowy, uszkodzenie lub infekcję i mogą być mobilizowane do pobudzania MOMP w drodze modyfikacji potranslacyjnych. Białka BH3-only najprawdopodobniej wzbudzają MOMP poprzez zapoczątkowanie oligomeryzacji Bax i/lub Bak w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, w której tworzą kanały, przez które uciekają liczne białka z przestrzeni międzybłonowej. W odniesieniu do uszkodzenia DNA stabilizacja białka supresora guzów p53 może prowadzić do aktywacji transkrypcji białek BH3-only, Puma i Noxa promujących MOMP poprzez kanał Bax-Bak. Alternatywna ścieżka apoptozy zależnej od p53 proponuje mechanizm z udziałem transkrypcyjnej nadregulacji białka PIDD. PIDD może promować tworzenie kompleksu własnego z RAIDD i kaspazą 2 (‘piddosomu’). Nie wiadomo dokładnie, jak piddosom może promować śmierć komórki, ale może w tym procesie uczestniczyć MOMP zależny od kaspazy 2. Niektóre białka mitochondrialne uwolnione przez MOMP (AIF, HtrA2/Omi, endonukleaza G) mogą promować śmierć komórki niezależną od kaspazy poprzez jeszcze bardzo słabo poznany mechanizm. Śmierć komórki niezależna od kaspaz może być także wynikiem pobudzeń prowadzących do zwiększonej przepuszczalności błony lizosomalnej (LMP) i zwiększonego uwalniania proteaz katepsynowych.

Shin S. et al. EMBO J. (2005) 24, 3532–3542 Proponowany mechanizm regulacji apoptozy z udziałem TRAIL. (Lewy schemat) Niska aktywność wewnątrzkomórkowego PKCK2 (1) lub wysoka aktywność wewnątrzkomórkowego PKCK2 jest obniżana przez specyficzny inhibitor (1’), defosforylowane monomery prokaspazy-2. Prokaspaza-2 jest następnie aktywowana w wyniku jej dimeryzacji (2), a zaktywowana kaspaza-2 tnie monomer prokaspazy-8 pomiędzy większą i mniejszą podjednostką (3). W takiej sytuacji dochodzi do ‘wzbudzenia’ apoptozy zależnej od TRAIL w komórkach nowotoworowych. Jeżeli TRAIL nie jest połączony z receptorami TRAIL-śmierć, cięta prokaspaza-8 jest kierowana do proteasomu celem degradacji (4). W przypadku przeciwnym TRAIL jest wiązany do swego receptora, przecięta prokaspaza-8 jest rekrutowana przez receptory śmierci TRAIL, czego wynikiem jest utworzenie DISC (4’). Drugie cięcie między prodomeną i podjednostką większą może być wykonane efektywnie w wyniku dimeryzacji ciętych prokaspaz-8, która zachodzi z udziałem DISC (5), co prowadzi do aktywacji prokaspazy-8 (6), a następnie apoptozy za pośrednictwem TRAIL (7). (Prawy schemat) Gdy wewnątrzkomórkowa aktywność PKCK2 jest wysoka prokaspaza-2 nie może być aktywowana; a zatem prokaspaza-8 nie może być przekształcana. Nawet z zaangażowaniem TRAIL, prokaspaza-8 w DISC nie może być aktywowana w pełni i w związku z tym nie wystąpi apoptoza z udziałem TRAIL.

Śmierć kaspazo-zależna Śmierć kaspazo-niezależna Śmierć z aktywacją kaspaz Śmierć z aktywacją kaspaz Śmierć bez aktywacji kaspaz Przeżycie Apoptoza Nekroza Śmierć apoptozo-podobna Śmierć autofagowa Apoptyczna śmierć komórki Niapoptyczna śmierć komórki Wpływ blokerów kaspaz Wyznaczone ścieżki Związki między kaspazo-zależnością i morfotypem śmierci komórki

M U T A C J E i ZaBU rzeNia PrZez REGULATORÓW A P O P T O Z Y CYKLU KOMÓRKOWEGO i

MUTACJE NIEAKTYWNE LIGANDY pro-kaspaza-8 Domena zewnątrz-komórkowa FasL Fas/CD95 Błona komórkowa FADD MUTACJE NIEAKTYWNE RECEPTORY Jądro komórkowe Bcl2 MUTACJE NIEAKTYWNE KINAZY Kaspazy wykonawcze & inne substraty kaspaza 3 cytochrom c kaspaza-9/cytochrom c mitochondria p15tBid ???PRZEMIANA NOWOTWOROWA??? = MUTACJE NIEAKTYWNA KASPAZA 8

(osiem białek znanych do 2001) Blokują apoptozę (osiem białek znanych do 2001)

MUTACJE NIEAKTYWNE LIGANDY pro-kaspaza-8 Domena zewnątrz-komórkowa FasL Fas/CD95 Błona komórkowa FADD Jądro komórkowe Bcl2 MUTACJE - NIEAKTYWNA KASPAZA 8 MUTACJE - NIEAKTYWNE RECEPTORY p53 Bax MUTACJE - NIEAKTYWNE KINAZY Kaspazy wykonawcze & inne substraty kaspaza 3 cytochrom c kaspaz-9/cytochrom c p15tBid mitochondria

NAPRAWA LUB APOPTOZA p53 p21WAF1/CIP CYKLINA Cdk CYKLINA : Cdk ATP pRB : E2F ADP pRB : E2F ppRB : E2F E2F FAZA G1 FAZA S FAZA G1 FAZA S NAPRAWA LUB APOPTOZA

(czternaście białek znanych do 2001) Wzbudzają apoptozę (czternaście białek znanych do 2001)

!!!PRZEMIANA NOWOTWOROWA!!! pro-kaspaza-8 Domena zewnątrz-komórkowa FasL Fas/CD95 Błona komórkowa FADD Jądro komórkowe Bcl2 MUTACJE NIEAKTYWNA KASPAZA 8 mitochondria p53 Bax MUTACJE MUTACJE MUTACJE !!!PRZEMIANA NOWOTWOROWA!!!

Complex

ZEWNĄTRZ CYTOPLAZMA Complex

BRAK REKRUTACJI DO COMPLEKSU ŚMIERCI BRAK AKTYWNOŚCI PROTEO- LITYCZNEJ (Wyniki mutacji) BRAK REKRUTACJI DO COMPLEKSU ŚMIERCI BRAK AKTYWNOŚCI PROTEO- LITYCZNEJ

Mutacje czynników wzbudzających apoptozę ***

NIEKONTROLOWANE PODZIAŁY GROMADZENIE MUTACJI p21WAF1/CIP CYKLINA : Cdk pRB : E2F ppRB : E2F E2F ATP ADP FAZA G1 FAZA S CYKLINA Cdk NAPRAWA LUB APOPTOZA MUTACJE NIEKONTROLOWANE PODZIAŁY GROMADZENIE MUTACJI

NIEKONTROLOWANE PODZIAŁY GROMADZENIE MUTACJI p21WAF1/CIP CYKLINA : Cdk pRB : E2F ppRB : E2F E2F ATP ADP FAZA G1 FAZA S CYKLINA Cdk NAPRAWA LUB APOPTOZA MUTACJE NIEKONTROLOWANE PODZIAŁY GROMADZENIE MUTACJI

NIEKONTROLOWANE PODZIAŁY GROMADZENIE MUTACJI p21WAF1/CIP CYKLINA : Cdk pRB : E2F ppRB : E2F E2F ATP ADP FAZA G1 FAZA S CYKLINA Cdk NAPRAWA LUB APOPTOZA MUTACJE NIEKONTROLOWANE PODZIAŁY GROMADZENIE MUTACJI

ZABURZENIA APOPTOZY 1. MUTACJE CZYNNIKÓW ZAANGAŻOWANYCH W APOPTOZĘ A/ RECEPTORY np. dla TNF lub Fas B/ LIGANDY C/ PROTEINAZY D/ TELOMERAZA E/ INNE ENZYMY (np.: DNA-azy, itp.) 2. MUTACJE CZYNNIKÓW CYKLU KOMÓRKOWEGO A/ KINAZY ZALEŻNE OD CYKLIN B/ CYKLINY 3. MUTACJE REGULATORÓW CYKLU KOMÓRKOWEGO A/ p53 B/ pRB C/ p21/WAF/CIP D/ BRCA

REMEDIUM???

Wymuszenie blokady cyklu komórkowego i aktywacja apoptozy

NOWE PODEJŚCIE DO LECZENIA NOWOTWORÓW TECHNOLOGIA SAANDs (Selective Apoptotic Antineoplastic Drugs) NOWE PODEJŚCIE DO LECZENIA NOWOTWORÓW Opracowane przez firmę biotechnologiczną Cell Pathways, Inc. Aptosyn™ (exisulind). Jest to kandydat nowej generacji leków. Wywołuje apoptozę wybiórczo w komórkach przed- i nowotworowych, przez co tylko komórki nowotworowe są zmuszane do samounicestwienia. W minimalnym stopniu uszkadza komórki normalne.

ZAŁOŻENIA TECHNOLOGII SAANDs NOWE LEKI MUSZĄ: Wzbudzać zaprogramowaną śmierć komórki (apoptozę) wyłącznie w komórkach przed- i nowotworowych. Wykazywać aktywność w szerokim spektrum linii komórek nowotworowych (wrażliwość na Aptosyn™ testowano dla ponad 50 linii). Działać synergicznie lub kumulująco z lekami chemioterapii konwencjonalnej. Posiadać mechanizm działania niezależny od dotychczas znanych szlaków regulujących apoptozę. http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

komórek raka odbytu człowieka (HT-29) HODOWLA komórek raka odbytu człowieka (HT-29) KONTROLA Komórka rakowa oporna Komórka rakowa nekrotyczna Komórki rakowe w obecności Aptosyn™ Komórka rakowa podlegająca Apoptozie http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

komórek raka prostaty człowieka (PC-3) HODOWLA komórek raka prostaty człowieka (PC-3) Komórka rakowa nie podlegająca apoptozie KONTROLA Komórki rakowe w obecności Aptosyn™ Komórka rakowa podlegająca apoptozie http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

EFEKTY TECHNOLOGII SAANDs Blokuje cykliczny GMP-PDE. Aktywuje kinazę białkową G Może być stosowany szeroko w chemo-prewencji przy leczeniu zaawansowa-nych nowotoworów http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

EFEKTY TECHNOLOGII SAANDs (c.d. 2) Nie blokuje COX I lub II i dlatego nie powoduje zagrożeń toksycznych, żołądkowo-jelitowego i nerkowego, typowych dla leków NSAIDs. Nie posiada działań ubocznych charakterystycz-nych dla terapii hormonalnych i chemioterapii. Jest stosowany doustnie http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

Konwencjonalna chemioterapia PORÓWNANIE Konwencjonalna chemioterapia i radioterapia wzbudzają nekrozę i apoptozę we wszystkich proliferujących komórkach. SAANDs wzbudza apoptozę wyłącznie w komórkach zmienionych nowotworowo (neoplastycznych) Istniejące leki chemioterapii oraz radioterpia wzbudzają apoptozę w szybko dzielących się komórkach bez rozróżnienia między komórkami neoplastycznymi i normalnymi. Śmierć normalnych komórek prowokuje liczne nieporządane skutki. Aptosyn™ i inne leki grupy SAANDs, takie jak CP-461 i CP-248 wzbudzają apoptozę wyłącznie w komórkach nowotworowych, jak to pokazano w badaniach ponad 50 różnych linii komórek nowotworowych, nie wywołując śmierci w komórkach sąsiednich w leczonej tkance. http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

MECHANIZM DZIAŁANIA APTOSYNTM APOPTOZA Aktywna Kaspaza Sygnał apoptotyczny GTP Cyklaza guanylowa cGMP-PDE Aktywny GMP Cykliczny GMP MECHANIZM DZIAŁANIA APTOSYNTM Aktywna Kinaza białkowa G b-katenina Kinaza białkowa G Aktywna Kaspaza http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

APTOSYNTM blokuje cGMP-PDE Aktywna Kinaza białkowa G b-katenina APOPTOZA Sygnał apoptotyczny GTP Cyklaza guanylowa cGMP-PDE Cykliczny GMP Kaspaza APTOSYNTM blokuje cGMP-PDE http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

nie blokuje aktywności COX I i II. APTOSYN™ Działa za pośrednictwem regulatorów apoptozy takich jak: p53, Bcl2 i Bax oraz nie blokuje aktywności COX I i II. http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

STOSOWANIE APTOSYNUTM u PACJENTA Z FAP/APC i GS (Familial Adenomatous Polyposis Coli) Polipy po stoswaniu AptosynuTM przez 6 miesięcy Polipy nieleczone Polipy po stoswaniu AptosynuTM przez 44 miesiące http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

pozwala uniknąć efektów ubocznych SAANDs pozwala uniknąć efektów ubocznych Radioterapia i liczne standardowe chemioterapeutyki takie jak np.: 5-fluorouracyl egzekwują kontrolę nowotworów przez specyficzne i niespecyficzne szlaki ragulatorowe. Aktywność apoptotyczna wywołana chemioterapeutykami i promieniowaniem jest wtórnym wynikiem ich stosowania wywołującego uszkodzenia w komórce. http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html

ZALETY SAANDs Leki SAANDs działają poprzez korektę uszkodzenia w głównym szlaku regulującym apoptozę. Odtwarzając przekazywanie sygnału szlakiem apoptotycznym, SAANDs stają się naczelnym aktywatorem apo-ptozy o najwyższej specyficzności w komórkach przeznaczonych de facto do usunięcia. http://www.cellpathways.com/3_RESEARCH/index.html