Metody wytwarzania biofarmaceutyków będących produktami metabolizmu wtórnego Inżynieria metaboliczna

Zwiększenie odporności na antybiotyki w wyniku zmian w genach STRATEGIE ZMIAN METABOLIZMU DROBNOUSTROJÓW MAJĄCE NA CELU ZWIĘKSZENIE WYDAJNOŚCI BIOSYNTEZY METABOLITÓW WTÓRNYCH LUB KONSTRUKCJĘ NOWYCH IDIOLITÓW– TECHNOLOGIA REKOMBINOWANEGO DNA Amplifikacja genów biosyntezy całego szlaku lub jego części – szczególnie genów kluczowych Zwiększenie odporności na antybiotyki w wyniku zmian w genach warunkujących odporność Klonowanie i ukierunkowana mutageneza genów regulatorowych Podłączenie genów biosyntezy idiolitu do tzw. „wczesnych promotorów” w celu przyśpieszenia ekspresji tych genów w cyklu rozwojowym promieniowców Zwiększenie wydzielania produktu poprzez zmiany w genach kodujących błonowe białka transportowe oraz białka regulujące systemy transportu Zmiany w genach kodujących białka regulatorowe (regulatory ogólne lub specyficzne dla szlaku) Celowe usunięcie etapów limitujących szybkość metabolizmu Wyłączenie genów kodujących enzymy odpowiedzialne za biosyntezę niepożądanych produktów ubocznych Przeniesienie całego procesu biosyntezy do innego heterologicznego organizmu produkcyjnego Przenoszenie, łączenie genów biosyntezy i ich mutageneza w celu konstrukcji idiolitów hybrydowych

Możliwe sposoby zwiększenia wydajności wytwarzania metabolitu wtórnego technikami inżynierii metabolicznej

Antybiotyki -laktamowe Produkcja poprzez biosyntezę: 1. Penicylina G i V, Cefalosporyna C jako żródła 6AP i &AC 2. Kwas klawulanowy Praktycznie wszystkie leki z tej grupy są związkami półsyntetycznymi penicyliny cefalosporyny cefamycyny kwas klawulanowy karbapenemy monobaktamy

Biogeneza różnych antybiotyków

Antybiotyki -laktamowe - penicyliny

Schemat końcowych etapów biosyntezy antybiotyków -laktamowych

Produkcja penicyliny G lub V Producent: Penicillum chrysogenum Szczepy produkcyjne wytwarzają do 70 g z litra hodowli. Wydajność szczepu wyjściowego – 60 mg z litra Głowny sposób konstrukcji szczepów Wysokowydajnych – powielenie genów biosyntezy (do 20 kopii) Prekursor – kwas fenylooctowy lub fenoksyoctowy

Schemat procesu wyodrębniania penicyliny G

Alternatywne możliwości otrzymywania 6APA z penicyliny G

Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego (6APA) Możliwe metody: hydroliza chemiczna lub enzymatyczna Warunki hydrolizy enzymatycznej Biotransformacja 12-15% (w/v) roztworu soli penicyliny G lub V przez immobilizowaną amidazę penicylinową. Podczas reakcji utrzymuje się pH na poziomie 7 – 8 poprzez dodawanie KOH lub NaOH. Produkty: 6APA oraz odpowiedni kwas (fenylooctowy lub fenoksyoctowy). 6APA izoluje się poprzez zakwaszenie mieszaniny poreakcyjnej do pH = 4.0 w obecności rozpuszczalnika organicznego nie mieszającego się z wodą. W tych warunkach 6APA wytrąca się, a kwas prekursorowy przechodzi do fazy organicznej i jest zwykle zawracany jako dodatek do nowej fermentacji Korzyści z zastąpienia chemicznej hydrolizy penicyliny G do 6APA przez hydrolizę enzymatyczną Eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników organicznych, toksycznych odczynników i odpadów oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia; prowadzenie reakcji w umiarkowanych warunkach; łatwa kontrola pH, temperatury; zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych;

Wytwarzanie penicylin półsyntetycznych Zasada: acylowanie 6APA Metody chemiczne: chlorki kwasowe, mieszane bezwodniki Metody enzymatyczne: zastosowane amidaz penicylinowych – na ogół mało efektywne; niezłe rezultaty przy zastosowaniu acylazy ampicylinowej z Pseudomonas melanogenes do otrzymywania ampicyliny. Reakcja w środowisku pH 6,0. Nowe tendencje – inżynieria białka zastosowana dla zmiany właściwości amidazy penicyliny G z E. coli w kierunku znacznego zwiększenia efektywności reakcji syntetycznej zastosowanie hydrolazy estrów -aminokwasów z Xantomonas citri do wytwarzania ampicyliny i amoksycyliny

Antybiotyki -laktamowe - cefalosporyny

Schemat końcowych etapów biosyntezy antybiotyków -laktamowych

Otrzymywanie kwasu 7-aminocefalosporanowego z cefalosporyny C w wyniku biotransformacji z użyciem oksydazy D-aminokwasowej i amidazy glutarylowej

Inne -laktamy Kwas klawulanowy – inhibitor -laktamazy Producent: Streptomyces clavuligerus Wytwarzanie: fermentacyjne Karbapenemy Producenci: Streptomyces Wytwarzanie: tienamycyna – fermentacja (brak zastosowania) imipenem, meropenem, biapenem – totalna synteza Monobaktamy Producenci: Agrobacterium, Chromobacterium, Pseudomonas, Gluconobacter, Acetobacter Wytwarzanie: kwas 3-AM z 6APA na drodze chemicznej jako półprodukt; totalna synteza (aztreonam, karumonam)

Biogeneza kwasu klawulanowego

Antybiotyki aminoglikozydowe Streptomycyna Producent: Streptomyces griseus. Polepszenie wydajności szczepu – 100 mg/L  20 – 30 g/L Warunki fermentacji: Pożywka – glukoza, mąka sojowa,WNK, sole Ważne: niskie stężenie fosforanów i soli amonowych. Induktor – czynnik A Dodatek 0.001 g czynnika A zapewnia wytworzenie 1 mg streptomycyny Inne wytwarzane fermentacyjnie: amikacyna, gentamycyna, tobramycyna

Inżynieria metaboliczna wytwarzania amikacyny

Antybiotyki tetracyklinowe Producenci: Tetracyklina i chlorotetracyklina – Streptomyces aureofaciens; Oksyteracyklina – S. rimosous Stymulacja biosyntezy chlorotetracykliny – dodatek chlorków (NaCl, 50 g/L), sole miedzi, D-metionina

Biogeneza antybiotyków tetracyklinowych Inżynieria metaboliczna wytwarzania tetracyklin Szczep S. aureofaciens z usuniętym genem odpowiedzialnym za wprowadzanie atomu chloru wytwarza jedynie tetracyklinę

Antybiotyki makrolidowe Biosynteza erytromycyny Producent: Streptomyces erythreus Podłoża: kwas propionowy lub propanol jako prekursor i induktor Inne – pochodne półsyntetyczne: klarytromycyna, cykliczny węglan (Davercin, opracowany w Polsce), Roksytromycyna, dirytromycyna Erytromycyna R = H Klarytromycyna R = CH3

Biogeneza antybiotyków makrolidowych Optymalizacja warunków hodowli: wysoka aktywność kinazy pirogronianowej, enzymu allosterycznego, katalizującego kluczowy etap początkowego szlaku biosyntezy prekursorów pierścienia laktonowego. Stymulacja kinazy pirogronianowej: cytrynian i/lub propanol jako składniki pożywki Inżynieria metaboliczna: powielenie genu mutazy metylomalonylo CoA [2-4]; ekspresja genów PKS i genów biosyntezy megozaminy w E. coli

Biosynteza erytromycyny Producent: Streptomyces erythreus Podłoże produkcyjne: Skład: glukoza i/lub skrobia, mąka sojowa lub kukurydziana, drożdże, siarczan amonu, NaCl, CaCO3, fosforany (5 – 15 mM), propanol lub kwas propionowy (dawki po 5 ml/L podłoża w pierwszej połowie procesu); Warunki: pH: 7 –7,2, maleje do 6,0, potem rośnie do 8,0; temperatura: 30 – 32 C w fazie wzrostu, 28 – 32 C w fazie produkcji. Proces biosyntezy trwa 120 – 144 h, Ograniczenie represji katabolicznej poprzez dozowanie glukozy z mniejszą szybkością w idiofazie i obecność skrobi. Ograniczenie represji azotowej poprzez dodatek zeolitu, dodatek WNK Wyodrębnianie produktu: produkt jest wydzielany pozakomórkowo; po zakończeniu biosyntezy zawiesinę pohodowlaną alkalizuje się do pH 7,5 – 8,0 lub zakwasza do pH 5,5, następnie oddzielenie grzybni na filtrze próżniowym z dodatkiem ziemi okrzemkowej; produkt z przesączu ekstrakcją octanem butylu lub ketonem metyloizobutylowym i reekstrakcją wodą o pH 5,5; zatężenie, krystalizacja z roztworu o pH 9,5, rekrystalizacja z roztworu wodno-acetonowego, suszenie. Alternatywnie wytrącenie z rozpuszczalnika organicznego w postaci kompleksu z KNCS. Ew. oczyszczanie – chromatografia jonowymienna lub adsorpcyjna,

Konstrukcja hybrydowych makrolidów ACP – białko przenoszące acyl AT – acylotransferaza DEBS – syntaza 6-deoksyerytronolidu B DH – dehydrataza ER – reduktaza enoilowa ( C=C) KS – ketoreduktaza KS – ketosyntaza TE - tioesteraza Modularna organizacja genów syntazy poliketydowej (PKS) w biosyntezie pierścienia erytromycyny

Konstrukcja hybrydowych makrolidów W DEBS1 wstawiono nową domenę DH/KR, a moduł 3 DEBS2 przyłączono do domeny TE DEBS 3. Produkt zawieraja podwójne wiązanie; Produkt I powstaje, gdy w module 6 DEBS3 wprowadza się specyficzną dla malonylo-CoA domenę AT, produkty II i III powstają gdy specyficzna dla malonyloCoA domenę AT wprowadza się do modułu 1 DEBS 1 lub do modułu 3 DEBS2; Moduł ładujący DEBS1 został zastąpiony przez moduł ładujący PKS biosyntezy awermektyny Centrum aktywne domeny KS modułu 1 DEBs1 zostało zmodyfikowane w wyniku ukierunkowanej mutagenezy, co zmieniło jego specyficzność substratową. Zastosowano nowe substraty

Polienowe makrolidy przeciwgrzybowe Amfoterycyna B (AMB) „złoty standard” w chemoterapii przeciwgrzybowej Producent: Streptomyces nodosus Wyodrębnianie Amfoterycyny B Modyfikacje AMB mające na celu poprawę selektywnej toksyczności: grupa karboksylowa i grupa aminowa Modyfikacje chemiczne: głównie KTLiB PG: MF-AME (ester metylowy N-metylo-N-D-fruktozylo-AMB) Modyfikacje biotechnologiczne: Konstrukcja szczepu S. nosodus z usuniętym genem amphN, kodującym enzym utleniający grypę metylową do karboksylowej. Efekt: biosynteza pochodnej AMB z grupą metylową w miejscu karboksylu.

Wankomycyna Producent: promieniowce z rodzaju Actinomycetes

Konstrukcja hybrydowych analogów Daptomycyny Daptomycyna – antybiotyk lipopeptydowy wytwarzany przez Streptomyces roseosporus. Struktura – 13 reszt aminokwasowych (w tym 6 reszt aminokwasów niebiałkowych) + reszta acylowa kwasu n-dekanowego). Aktywność przeciwbakteryjna; działa na bakterie gramdodatnie, w tym na oporne na metycylinę S. aureus (MRSA), oporne na penicylinę S. pneumoniae (PRSP), i oporne na wankomycynę S. aureus (VRSA) i enterokoki (VRE). Zaaprobowany do lecznictwa klinicznego przez FDA. Biogeneza - nierybosomalna syntetaza peptydowa (NRPS). Klaster genowy biosyntezy daptomycyny dpt zawiera m.in. trzy geny: dptA, dptBC i dptD, kodujące trzy podjednostki NRPS. Podjednostki NRPS mają budowę modułową. Moduł odpowidzialny za wbudowanie reszty aminokwasowej. W module zawsze domeny A (adenylacja), C (kondensacja) oraz T (tiolacja). Ponadto możliwe domeny E (epimeryzacja). Ułożenie modułów w NRPS zgodne z kolejnością reszt aminokwasowch w finalnym produkcie

Konstrukcja hybrydowych analogów Daptomycyny Możliwości konstrukcji hybrydowych analogów daptomycyny

Konstrukcja hybrydowych analogów Daptomycyny Konstrukcja hybrydowego dptCB. Region kodujący CAT modułu D-Ala8 został zastąpiony przez kasetę oporności na antybiotyk flankowaną rzadkimi miejscami restrykcyjnymi. Kaseta została następnie wycięta, a liniowy plazmid wykorzystany do ligacji ze sklonowanym fragmentem zawierającym CAT innego modułu (D-Ser11).

Konstrukcja hybrydowych analogów Daptomycyny Aktywność przeciwbakteryjna (S. aureus) daptomycyny i hybrydowych analogów. Wszystkie analogi, oprócz zmian w sekwencji aminokwasowej, posiadają także 11-węglową resztę acylową zamiast 10-węglowej Spektrum daptomycyny i hybrydowych analogów. analog CB18220 posiada sekwencję aminokwasową daptomycyny, ale 11-węglową resztę acylową

Antybiotyki przeciwnowotworowe Antybiotyki przeciwnowotworowe mogą wykazywać działanie cytotoksyczne, kardiotoksyczne i/lub mutagenne. Specjalne wymogi podczas produkcji: stosowanie zabezpieczeń technicznych tworzących bariery biologiczne wokół procesu produkcyjnego*; neutralizacja wszelkich produktów, odpadów i ścieków; odpowiednie przeszkolenie personelu, konieczność zabezpieczenia środków ochronnych *uniemożliwienie tworzenia się aerozoli; pomieszczenia technologiczne w warun- kach obniżonego ciśnienia; powietrze wylotowe musi być filtrowane Antybiotyki antracyklinowe Daunorubicyna – producent Streptomyces peuceticus. Inżynieria metaboliczna. Inaktywacja genów dnrX i dnrH kodujacych enzymy przekształcające daunorubicynę i doksorubicyne w poliglikozylowane pochodne