Kinetyka reakcji enzymatycznych Enzymologia-9

Metody pomiaru szybkości reakcji enzymatycznych: reakcje sprzężone D -Glc + ATP D -Glc-6-P + ADP D-Glc-6-P D-glukono- -lakton-6-P NADP + NADPH Dehydrogenaza Glc-6-P Heksokinaza pomiary zmian fluorescencji

pomiar szybkości przez zastosowanie związków zawierających izotopy promieniotwórcze - 14 COOH Dekarboksylaza ornitynowa 14 CO 2 ornityna putrescyna

Warunki badania szybkości reakcji: 1.Substraty i bufory odpowiedniej jakości i czystości 2.Aktywny preparat enzymatyczny 3.Enzym powinien być stabilny w warunkach prowadzenia pomiarów 4.Optymalna temperatura oraz pH prowadzenia reakcji 5.Odpowiednia metoda zatrzymywania reakcji enzymatycznej: - temperatura 100°C - 1% roztwór SDS - w przypadku metaloenzymów dodatek EDTA - dodanie silnego kwasu np.: trichlorooctowego (2-3%) 6.Podczas oznaczenia zapewnione warunki stanu ustalonego reakcji enzymatycznej

Określanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej

Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkach stanu stacjonarnego

Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkach stanu przedstacjonarnego

Kinetyka reakcji enzymatycznej Model Michaelisa-Menten

KINETYKA REAKCJI MONOSUBSTRATOWYCH Równanie opisujące kinetykę reakcji można ułożyć przyjmując jedno z założeń: a. Założenie równowagik 2 << k -1 wprowadzając, oraz: v = k 2 [E:S], jak również wiedząc, że na całkowite stężenie enzymu składa się stężenie enzymu wolnego oraz enzymu tworzącego kompleks z substratem, czyli: [E c ] = [E] + [E:S], otrzymuje się ostatecznie:, lub, gdzie k kat = k 2 to stała katalityczna Ponieważ enzym działa z maksymalną szybkością V, jeżeli wszystkie jego cząsteczki tworzą kompleks z substratem, czyli gdy [E:S] = [E c ], to: V = k kat [E c ] Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu r-gi nosi nazwę stałej substratowej i jest często określana symbolem K s.

b. Założenie stanu ustalonego = 0; = k 1 [E][S] – (k -1 [E:S] + k 2 [E:S]) wprowadzając stałą i przekształcając równanie otrzymuje się: v = Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu ustalonego nosi nazwę stałej Michaelisa - K M. Warto zauważyć, że K M = K s +, czyli K M = K s, jeżeli k 2 <<k 1

GRAFICZNE METODY WYZNACZANIA STAŁYCH KINETYCZNYCH 1.Równanie Lineweavera-Burka

2. Równanie Eadiego-Hofstee 3. Równanie Hanesa

Bezpośredni wykres liniowy

Znaczenie parametrów kinetycznych K M – stanowi miarę stężenia substratu wymaganego do osiągnięcia znaczącej szybkości reakcji; przy tym stężeniu połowa miejsc aktywnych jest obsadzona. Większość enzymów działa w warunkach, w których [S] jest bliskie K M lub nieco od niego mniejsze. Jeżeli K M jest bliskie K s, to można uznać tą wartość za miarę powinowactwa enzymu do danego substratu. V - szybkość działania enzymu w warunkach pełnego wysycenia substratem, czyli gdy [S] >> K M. Stanowi miarę efektywności katalitycznej.

W warunkach fizjologicznych [S]/K M mieści się zwykle między 0,01 a 1,0. W tych warunkach tylko niewielka liczba miejsc aktywnych jest zajęta, a enzym działa z szybkością dużo mniejszą od V (czyli k kat ). Prawdziwa jest przybliżona zależność: (przy czym [E] [E] c ) a stosunek k kat /K M jest miarą wydajności katalitycznej enzymu.

Znaczenie parametru (i) Określanie specyficzności enzymu wobec danego substratu podstawiając [E c ] = [E] + [E:S] i pamiętając, że, otrzymujemy i ostatecznie gdzie - pozorna drugorzędowa stała szybkości jeżeli [S 1 ] = [S 2 ], to

( ii) założenie stanu ustalonego, czy założenie równowagi? Z założenia stanu ustalonego: Jeżeli k 2 >>k -1, co jest ekstremalną formą założeń stanu ustalonego, to:, czyli: Jeżeli szybkość wiązania substratu jest kontrolowana dyfuzyjnie, to k M s -1 Jeżeli wartość jest tego rzędu, to założenie stanu ustalonego ma sens, natomiast, jeżeli << 10 9, to właściwsze jest założenie równowagi. Enzymy, dla których znajduje się pomiędzy M -1 s -1 osiągnęły perfekcję kinetyczną, tzn. ich szybkość katalityczna jest ograniczona wyłącznie szybkością dyfuzji substratów

KINETYKA REAKCJI DWUSUBSTRATOWYCH a.Mechanizm tworzenia kompleksu E + A + B [E:A:B] [E:P:Q] E + P +Q Kompleks może się tworzyć w sposób: - uporządkowany (ordered binding) E + A [E:A][E:A] + B [E:A:B]E + B nie tworzą [E:B] - przypadkowy (random binding) E + A [E:A] [E:A] + B [E:A:B] E + B [E:B][E:B] + A [E:A:B] b. mechanizm ping-pong E + A E + P E + B E + Q

Mechanizm ping-pong Mechanizm reakcji katalizowanej przez karboksylazę pirogronianową pirogronian szczawiooctan

MODEL OGÓLNY WIĄZANIA K A i K B – stałe Michaelisa dla każdego z substratów przy wysycających stężeniach drugiego substratu V – szybkość maksymalna przy wysycających stężeniach obu substratów RÓWNANIA KINETYCZNE - dla mechanizmu tworzenia kompleksu - dla mechanizmu ping-pong

OKREŚLANIE TYPU MECHANIZMU REAKCJI DWUSUBSTRATOWEJ NA PODSTAWIE DANYCH KINETYCZNYCH Dokonuje się pomiarów szybkości reakcji dla różnych wartości [A 0 ] utrzymując stałe [B]. Powtarza się to dla kilku wartości [B]. Sporządza się wykresy w układzie Lineweavera-Burkea. a.Jeżeli otrzymuje się układ prostych przecinających się, to reakcja przebiega z utworzeniem kompleksu Dla każdej linii określa się nachylenie i punkt przecięcia z osią 1/v Tworzy się wykresy wtórne

b. Jeżeli otrzymuje się układ prostych równoległych, to reakcja przebiega mechanizmem ping-pong Jedyny wykres wtórny:

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Stosując założenie stanu równowagi można wyprowadzić następujące równania ogólne: K ES = K M ; K EI = K I

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Założenie ograniczające: K ESI = ; ES nie może łączyć się z I, a EI z S V = V; K M > K M Inhibicja kompetytywna

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Założenie ograniczające: K ESI = K EI ; wiązanie S nie wpływa na wiązanie I V < V; K M = K M Inhibicja niekompetytywna

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Założenie ograniczające: K EI = ; I łączy się tylko z ES V < V; K M < K M Inhibicja pozakompetytywna