Gabriela Gołąb III rok OAM grupa A1 ANALITYCZNE ASPEKTY OZNACZENIA ENZYMÓW I ICH PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA. PROBLEMY ANALITYCZNE OZNACZANIA BILIRUBINY Gabriela Gołąb III rok OAM grupa A1

ENZYMY Wielkocząsteczkowe, w większości białkowe, katalizatory przyspieszające specyficzne reakcje chemiczne poprzez obniżenie ich energii aktywacji Enzym katalizuje reakcje przekształcania substratów w produkty, a szybkość tej reakcji jest zależna od ilości aktywnego enzymy w środowisku reakcji

ENZYMY JEDNOSTKI AKTYWNOŚCI ENZYMÓW: 1 JEDNOSTKA (1 UNIT) – to taka ilość enzymu, która w standardowych warunkach katalizuje powstawanie lub rozpad 1mikromola substratu/produktu w ciągu 1 min 1 KATAL (1KAT)– to taka ilość enzymu, która w standardowych warunkach przekształca 1 mol substratu w ciągu 1s (jednostka zgodna z układem SI) 1 kat = 6∙107 U 1 U = 16,67∙10-9 kat = 16,67 nkat

ENZYMY Apoenzymy – części białkowe enzymów Koenzymy – drobnocząsteczkowe związki organiczne lub jony nieorganiczne, których obecność w centrum aktywnym jest niezbędna do katalitycznego działania enzymu (koenzym silnie związany z cząsteczką białka = grupa prostetyczna) Grupy prostetyczne i koenzymy (kosubstraty) ulegają przemianie podczas reakcji enzymatycznej powracają do pierwotnej postaci w wyniku reakcji wtórnej Część białkowa – decyduje o: specyficzności w stosunku do substratu (jaki rodzaj substratu ulega przemianie) kierunku reakcji

IZOENZYMY Zakodowane w DNA, fizycznie odmienne postacie danego enzymu – różnią się: - wrażliwością na temperaturę - wrażliwością na działanie różnych związków chemicznych - powinowactwem do substratu - ruchliwością elektroforetyczną - właściwościami immunologicznymi katalizują tę samą reakcję występują w różnych typach komórek lub komparmentach subkomórkowych przykłady izoenzymów: LDH, CK, ALP

IZOFORMY Odmienne fizycznie postacie danego enzymu powstające w wyniku modyfikacji potranslacyjnej (np. glikozylacja, hydroksylacja, oksydacja)

OZNACZANIE ENZYMÓW pomiar ilości enzymu – po jego wyizolowaniu z badanego materiału pomiar aktywności enzymu – na podstawie szybkości katalizowanej reakcji uzyskujemy informację o ilości enzymu

STANDARYZACJA OZNACZANIE ENZYMÓW stosowanie jednej jednostki aktywności reakcji enzymatycznej - katali stosowanie przez producentów do kalibracji metod co najmniej drugorzędowego wzorca aktywności enzymatycznej stosowanie szczegółowo opisanych metod aktywność enzymu musi być stała w czasie oznaczania mierzona aktywność enzymu musi być proporcjonalna do rozcieńczenia próbki zakres roboczy metody musi odpowiadać zakresowi wielkości aktywności enzymu mierzonej w laboratorium reakcję enzymatyczną należy zawsze prowadzić w temperaturze 37°C

WARUNKI REKACJI ENZYMATYCZNEJ TEMPERATURA termostabilność enzymu – najwyższa temperatura, w której nie dochodzi jeszcze do termicznej inaktywacji enzymu pH I SIŁA JONOWA Optymalne pH: 7-8 dla większości enzymów 1,5 pepsyna 4-6 fosfataza kwaśna 8-10 fosfataza alkaliczna STĘŻENIE SUBSTRATU INHIBITORY (substancje nisko- lub wysokocząsteczkowe lub jony)

WARUNKI REKACJI ENZYMATYCZNEJ AKTYWATORY jony (Mn+2, Fe+2, Co+2, Zn+2, K+) - Zn+2 – fosfataza alkaliczna i karboksypeptydaza - Cl-, Br- - amylaza - Mg+2 – kinaza kreatynowa aktywatory prekursorów enzymów koenzymy/kosubstraty - NAD+, NADP+, FAD - dehydrogenazy - fosforan pirydoksalu (PLP) – aminotransferazy - pochodne witamin z grupy B

ENZYMY 1. Enzymy komórkowe (wskaźnikowe) – uwalniane w wyniku uszkodzenia błony komórkowej lub rozpadu komórki - mikrosomalne – GGT - lizosomalne – ACP - mitochondrialne – AST, CK, GLD - cytoplazmatyczne – ALT, LDH, AST, CK - błony plazmatyczne – ALP, GGT 2. Enzymy sekrecyjne – wydzielane do krążenia, gdzie spełniają swoją funkcję - czynniki krzepnięcia i fibrynolizy - acylotransferaza lecytyna:cholesterol (LCAT) - cholinesteraza ChE (pseudocholinesteraza) 3. Enzymy ekskrecyjne – produkowane przez gruczoły i wydzielane do śliny, światła przewodu pokarmowego, płynu nasiennego itp. - amylaza - lipaza

ENZYMY – WARTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Kwaśna fosfataza (ACP) - prostata Alkaliczna fosfataza (ALP) – wątroba, kości Amylaza - trzustka Lipaza - trzustka Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) – wątroba, serce Transaminaza Asparanginowa (AST) – wątroba, serce Transaminaza Alaninowa (ALT) – wątroba, serce Kinaza Kreatynowa (CK) – serce , mięśnie, mózg

ENZYMY – STOSOWANE UKŁADY POMIAROWE Test optyczny 2. Analogi naturalnych substratów Fosfatazy ( p-nitrofenylofosforan, a-naftylofosforan Amylaza (p-nitrofenylo-D-maltoheptozyd, 2-chloro-p-nitrofenylo-aD-maltotriozyd 3. Substancje, z których pod wpływem enzymów powstają barwne produkty reakcji (3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna (TMB)) 4. Przeciwciała – metody immunoturbidymetryczne, radioimmunologiczne, immunoenzymatyczne

PRZYKŁADY ENZYMÓW

FOSFATAZA KWAŚNA - ACP Enzym należący do hydrolaz Katalizuje hydrolizę różnych estrów fosforanowych Występuje w dużych stężeniach w gruczole krokowym i w chorobach kości WZROST: choroby kości, rak prostaty, nadmierny rozpad erytrocytów lub trombocytów

FOSFATAZA ALKALICZNA (ALP) Enzym wątroby, układu krążenia, układu kostnego WZROST: choroby kości lub wątroby, nadmierna aktywność osteoblastów, upośledzenie wydzielania żółci, choroby jelit Wyróżniamy kilka form izoenzymów ALP : ALPI – jelitowa ALPL – tkankowa ALPP – łożyskowa LAP – leukocytarna Metody rozdziału: elektroforeza żelowa analiza produktów denaturacji inhibicja mocznikiem techniki immunologiczne

AMINOTRANSFERAZY Enzymy wątroby, układu krążenia Niespecyficzne enzymy indykatorowe, biorące udział w przemianach białek Transferazy – przenoszą grupy aminowe z aminokwasów na alfa-ketokwasy PLP – koenzym

AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA (AST) Występuje w cytoplazmie i mitochondriach komórek wątroby, w mięśniach, kanalikach nerkowych i erytrocytach Katalizuje reakcje : alfa-ketoglutaran + L-asparanginian -> L-glutaminian + szczawiooctan Normalny zakres : 5-34 U/L WZROST: uszkodzenie wątroby, nerek, mięśni szkieletowych, w zawale mięśnia sercowego

AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA (AST) OZNACZANIE: Metoda Karmena: L-asparanginian+alfa-ketoglutaron  L-glutaminian + szczawiooctan Szczawiooctan + NADH+ H+ jabłaczan + NAD+ Mierzenie spadku absorbcji przy 340nm , który jest proporcjonalny do aktywności enzymu

AMINOTRANSFERAZA ALANINIOWA (ALT) Występuje w cytoplaźmie komórek wątroby i w mięśniach poprzecznię prążkowanych serca Katalizuje reakcje : alfa-ketoglutaran + alanina  glutaminian + pirogronian Normalny zakres : 10-40 U/L WZROST: uszkodzenie wątroby, mięśni szkieletowych, w zawale mięśnia sercowego

AMINOTRANSFERAZA ALANINIOWA (ALT) OZNACZANIE: Metoda Wróblewskiego i La Due’ego: L-alanina + alfa-ketoglutaron  L-glutaminian + pirogronian Pirogronian + NADH+ H+ mleczan + NAD+ Mierzenie spadku absorbcji przy 340nm, który jest proporcjonalny do aktywności enzymu

Znaczenie kliniczne aminotransferaz WZROST AKTYWNOŚCI: 100x – ciężkie uszkodzenie wątroby 10-30x – ostre WZW 100-1000U/L autoimmunologiczne zapalenie wątroby 1,5-5x – marskość wątroby 2-3x – zastój w krążeniu wrotnym, cholestaza, przewlekłe choroby mięśni, ONN

WSKAŹNIK DE RITISA Jest to stosunek aktywności aminotransferazy asparaginowej do aminotransferazy alaninowej (AST/ALT) Prawidłowo:wkaźnik >1 >2 – alkoholowe zapalenie wątroby <1 – ostre wirusowe zapalenie wątroby >1 – przewlekłe zapalenie wątroby >2 – zawał serca (2doba)

KINAZA KREATYNOWA (CK) Katalizuje odwracalną reakcję przenoszenia grupy fosforanowej na ADP regenerując ATP lub z ATP na kreatynę odbudowując zapasy fosfokreatyny NORMA : 0-16 U/L Znaczenie kliniczne: choroby mięśni szkieletowych, serca, choroby OUN, tarczycy

DEHYDROGENAZA MLECZANOWA (LDH) Katalizuje odwracalną konwersję mleczanu w pirogronianian i odwrotnie Kofaktor: NADH/NAD+ NORMA: 80-285 U/L WZROST: hemoliza erytrocytów, rozpad tkanek, zawał mięśnia sercowego (8-12h po ustąpieniu bólu) Niewielki wzrost: choroby wątroby, anemia, choroby nerek, dystofia mięśni

LDH - IZOENZYMY LD1 – serce, erytrocyty LD2 – leukocyty LD3 – płuca LD4 – nerki, łożysko LD5 – mięśnie, wątroba Metoda rozdzielania i oznaczania izoenzymów LDH: Elektroforeza żelowa Selektywne metody chemicznej inhibicji Chromatografia jonowymienna Immunostrącanie

AMYLAZA Występuje w soku trzustkowym i w ślinie Zapoczątkowuje proces trawienia skrobi NORMA: 35-140 U/L WZROST: zapalenie trzustki, urazy ślinianek, alkoholizm, świnka, niewydolność nerek Metody oznaczania: -metoda skrobiowa (test sacharogeniczny, amyoklastyczny, chromogeniczny) -metoda z innymi substratami

LIPAZA Hydrolizuje wiązania estrowa TG, czego produktami są WKT i gliceryna NORMA: 0-62 U/L WZROST: choroby trzustki, perforacja wrzodu żołądka Metody oznaczania: miareczkowanie kwas-zasada turbinymetria Spektrofotometria test immunologiczny

BILIRUBINA Pomarańczowoczerwony barwnik żółciowy, produkt rozpadu hemu hemoglobiny i innych hemoprotein Bilirubina jest związkiem słabo rozpuszczalnym w wodzie, stąd w osoczu krwi transportowana jest w połączeniu z białkiem – albuminą. Frakcja bilirubiny nietrwale związanej z albuminami nazywana jest bilirubiną wolną lub pośrednią. Bilirubina wolna nie przedostaje się do moczu, może jednak przenikać barierę krew-mózg Bilirubina wolna transportowana jest do wątroby, gdzie ulega dalszym przemianom do rozpuszczalnej w wodzie bilirubiny związanej (bezpośredniej), przez co traci zdolność przenikania bariery krew-mózg i przestaje być związkiem neurotoksycznym. UDP-glukuronozylotransferaza sprzęga bilirubinę z kwasem glukuronowym (glukuronianem)

HIPERBILIRUBINEMIA Podwyższenie poziomu bilirubiny w surowicy we krwi NORMA: Bilirubina całkowita: 0,2 – 1,0 mg/dl (3 – 17 μmol/l) Bilirubina sprzężona: 0,0 – 0,2 mg/dl (0 – 3 μmol/l) Bilirubina niesprzężona: 0,2 – 0,8 mg/dl (3 – 14 μmol/l) Bilirubina całkowita – noworodki <12 mg/dl (205 μmol/l)

ZABURZENIA METABOLIZMU BILIRUBINY HIPERBILIRUBINEMIA WOLNA Fizjologicznie u noworodków Hemoliza i zaburzenia erytropoezy Zespół Criglera-Najjara (wrodzony niedobór UGT) Zespół Gilberta (zredukowana aktywność transferazy lub zaburzony transport do hepatocytów)

ZABURZENIA METABOLIZMU BILIRUBINY HIPERBILIRUBINEMIA POŚREDNIA Cholestaza węwnątrzwątrobowa wrodzona – zespół Dublin-Johnsona, zespół Rotora nabyta – marskość wątroby, alkoholizm, żywienie pozajelitowe, posocznica Cholestaza zewnątrzwątrobowa zamknięcie dróg żółciowych od wewnątrz (kamienie żółciowe, nowotwory) ucisk dróg żółciowych z zewnątrz

DIAGNOSTYKA RÓŻNICOWA ŻÓŁTACZKI HEMOLITYCZNA MIĄŻSZOWA MECHANICZNA BILIRUBINA POŚREDNIA/BEZPOŚRENA 90 : 10 % 40 : 60 % 20 : 80 % BILIRUBINA W MOCZU brak podwyższona b.podwyższona UROBILINOGEN wzmożony obniżony/brak STERKOBILINOGEN obniżony KOLOR MOCZU jasny ciemny b.ciemny KOLOR STOLCA b.Jasny AspAT/AlAT norma b.podwyższony wzrost ALP GGTP LDH ŚWIĄD SKÓRY Możliwy tak

METODY OZNACZANIA BILIRUBINY 1. WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA (HPLC) pozwala rozdzielić bilirubinę na 4 frakcje: alfa – frakcja bilirubiny wolnej beta – frakcja bilirubiny sprzężonej (monoglukuronid bilirubiny) gamma – frakcja bilirubiny sprzężonej (diglukuronid bilirubiny) delta – frakcja bilirubiny sprzężonej, związanej kowalencyjnie z albuminami; nie występuje u osób zdrowych i pojawia się przy wysokich, utrzymujących się stężeniach bilirubiny sprzężonej; utrzymuje się we krwi ok. 2 tygodni Metoda HPLC nie ma szerokiego zastosowania w rutynowej diagnostyce.

METODY OZNACZANIA BILIRUBINY 2. REAKCJA EHRLICHA – reakcja w której dwuazowany kwas sulfanilowy reaguje z bilirubiną z wytworzeniem dwóch barwnych izomerów (pH obojętne – kolor purpurowy, pH kwaśne lub zasadowe – kolor niebieski 3. METODA DER BERGA I MULLERA – gdzie po dodaniu alkoholu następuje przyspieszenie sprzęgania bilirubiny frakcja BR reagująca bez dodatku alkoholu – BR bezpośrednia frakcja BR nie reagująca bez dodatku alkoholu – BR pośrednia *dodatek alkoholu powoduje zmętnienie

METODY OZNACZANIA BILIRUBINY 4. METODA JENDRASSIKA I GROFA BR całkowita – do roztworu dodaje się odczynnika kofeionowo-benzoesowego, a następnie dwufazowy kwas sulfanilowy. Reagują wszystkie formy BR. Następnie dodaje się kwas askorbinowy, winian i HCl. Mierzenie absorbancji 600nm BR związana – roztwór zakwasza się HCl i dodaje się dwuazowany kwas sulfanilowy. Z odczynnikiem reaguje tylko zestryfikowana BR i delta-BR. Następnie dodaje się kwas askorbinowy, winian i odczynnik kofeionowo-benzoesowy. Mierzenie absorbancji 600nm

METODY OZNACZANIA BILIRUBINY W MOCZU Przy użyciu testów paskowych Ekspozycja na światło powoduje rozpad bilirubiny Wyniki fałszywie dodatnie: NSLPZ Wyniki zaniżone: wysokie stężenie witaminy C, azotyny, ekspozycja na światło

BILIRUBINOMETR Urządzenie do nieinwazyjnego przeskórnego pomiaru poziomu bilirubiny u noworodków. Na pomiar nie ma wpływu płeć, wiek urodzeniowy, rasa ani waga noworodka. Po zwirowaniu krwi należy zmierzyć bezpośrednio absorbancje w spektrofotometrze przy dwóch długościach fali

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ