Analityczne aspekty oznaczania enzymów i ich przydatność diagnostyczna Analityczne aspekty oznaczania enzymów i ich przydatność diagnostyczna. Problemy analityczne oznaczania bilirubin. Anna Sepioło gr. B2 III OAM

Enzymy są to białka zdolne do katalizowania reakcji przekształcenia substratów w produkty poprzez obniżenie energii aktywacji tej reakcji. enzym substrat produkt

Klasyfikacja enzymów enzymy komórkowe pozakomórkowe sekrecyjne ekskrecyjne

Enzymy komórkowe Miejscem ich działania są komórki. Enzymy są związane z różnymi organellami komórkowymi (cytoplazma, błona komórkowa, mitochondria, lizosomy, ER). Pojawiają się w dużych ilościach po uszkodzeniu narządów. Należą do nich m.in. AspAT, AlAT.

Enzymy pozakomórkowe Są to enzymy produkowane przez komórki i wydzielane do środowiska pozakomórkowego gdzie pełnią swoje funkcje: Enzymy sekrecyjne: po uszkodzeniach komórek (np. hepatocytów) zachodzi spadek ich aktywności, ponieważ ich ilość zależy od syntezy w rybosomach należą do nich min. czynniki krzepnięcia krwi oraz fibrynolizy, esterazy cholinowe i lipaza lipoproteinowa. Enzymy ekskrecyjne: przeszkoda w normalnym odpływie różnych wydzielin ustrojowych, takich jak: żółć, sok trzustkowy, ciecz sterczowa czy ślina, powoduje zastój wydzieliny i przedostanie się enzymów do krwiobiegu należą do nich enzymy soku trzustkowego, żółci oraz fosfataza sterczowa

Izoenzymy Formy molekularne enzymu mające zdolność katalizowania reakcji enzymatycznej charakterystycznej dla danego enzymu, ale różniące się budową, ponieważ są kodowane przez różne strukturalnie geny. Strukturalne różnice izoenzymów odbijają się w różnym stopniu na ich właściwościach, co umożliwia jednocześnie ich rozróżnienie (ruchliwość elektroforetyczna – LDH, inhibicja przez L-winian).

Izoformy Różne formy tego samego enzymu w surowicy Powstają na skutek różnych rodzajów modyfikacji potranslacyjnych cząsteczki enzymu: acylacja zmiana bocznego łańcucha węglowodanowego częściowe rozszczepienie łańcucha deaminacja utlenienie gr. SH zmiana fosforylacji asocjacja z innymi białkami, agregacja

Warunki jakie powinien spełniać enzym przydatny dla celów diagnostyki klinicznej: enzym powinien być obecny we krwi, moczu lub innych łatwo osiągalnych płynach ustrojowych względna łatwość oznaczania znaczące różnice poziomów aktywności w stanie patologicznym i normalnym stabilność enzymu w płynie ustrojowym pożądana cecha – specyficzność tkankowa

Cele diagnostyki enzymologicznej monitorowanie przebiegu chorób rozpoznawanie chorób prognozowanie

Cele diagnostyki enzymologicznej Pomiar uszkodzenia tkanek. Identyfikacja organu, w którym nastąpiło uszkodzenie. Określenie rozległości uszkodzenia. Pomiar ciężkości uszkodzenia komórkowego. Diagnostyka leżącej u podstaw choroby. Diagnostyka różnicowa choroby wewnątrz organu.

Informacje diagnostyczne z: Poziomu aktywności enzymu w próbce. Określenia wzorów enzymów (kilka enzymów jednocześnie). Określenia aktywności enzymu w relacji do innych enzymów. Monitorowania aktywności enzymu. Oznaczania izoenzymów.

Oznaczanie aktywności enzymów Enzym katalizuje reakcję przekształcenia substratów w produkty, a szybkość tej reakcji jest zależna od ilości aktywnego enzymu w środowisku reakcji. Pomiar szybkości reakcji odbywa się w ustalonych i ściśle kontrolowanych warunkach (pH, temperatura, stężenie substratów, aktywność innych enzymów biorących udział w reakcji), w określonym przedziale czasu.

Jednostki aktywności enzymów Jednostka enzymatyczna (IU) jest to taka ilość enzymu, która w standardowych warunkach katalizuje przekształcenie 1 μmola substratu w ciągu 1 minuty, w warunkach optymalnych dla danego enzymu. Katal (kat) jest jednostka aktywności enzymatycznej obowiązująca w układzie SI; to taka ilość enzymu, która w standardowych warunkach przekształca 1 mol substratu w ciągu 1 sekundy. 1 kat – 6x107 IU 1 IU = 1 μmol/min 1 kat = 1 mol/s → 60 mol/min → 6x107 IU 1 μkat/L = 60 IU/L 1 IU/L = 16,7 μkat/L

Typowe przyczyny zmian aktywności enzymów we krwi

Co przeszkadza w diagnostyce enzymologicznej? Spożywanie pokarmów (↑AST, ALT, ALP) Sposób pobrania materiału (pozycja ciała, staza) Wiek (↑ i ↓), np. AST u kobiet Ćwiczenia fizyczne (↑CK, AST, LDH) Dieta Ciąża (↑CK) Alkohol (GGT) Leki Hemoliza Stabilność enzymów

Pomiar szybkości reakcji enzymatycznej Porównywalność oznaczeń enzymatycznych jest możliwa tylko przy stosowaniu tych samych warunków. Warunki reakcji to kompromis pomiędzy optymalnymi warunkami dla reakcji chemicznej, wymaganiami technicznymi, praktycznością i ceną.

Testy kinetyczne z fotometrycznym pomiarem zmian absorbancji Metoda dwupunktowa Metoda kinetyczna (ciągły pomiar)

Zasada pomiaru aktywności enzymów 1) Kofaktory oznaczanych enzymów 2) Analogi naturalnych substratów 3) Substancje, z których pod wpływem reakcji enzymatycznej powstają barwne produkty, np. TMB

1) Kofaktory oznaczanych enzymów Pomiar spadku/wzrostu absorbancji pochodzący od powstającego/zużywanego w reakcji enzymatycznej NADH lub NADPH. NADH/NAD+ i NADPH/NADP+ są kofaktorami używanymi przez wiele enzymów. Redukcja NAD+ do NADH i NADP+ do NADPH może być monitorowana przy 340 nm, ponieważ forma utleniona nie absorbuje światła przy tej długości fali.

Wykres absorbancji dla NADH przy różnych długościach fali

2) Analogi naturalnych substratów Pomiar wzrostu absorbancji pochodzący od powstającego p-nitrofenolu. p-nitrofenol może zostać sprzęgnięty z wieloma związkami chemicznymi, tworząc sztuczny substrat dla oznaczanego enzymu. Enzym katalizuje reakcję odszczepienia p-nitrofenolu, który tworzy żółto zabarwiony anion p-nitrofenolanowy.

Kalibracja oznaczeń aktywności enzymów Wzorzec międzynarodowy aktywności enzymów – używany przez firmy do kalibracji odczynników i obliczenia faktora. W laboratorium – najczęściej użycie faktora podanego przez producenta odczynnika MRCM – Multi – Enzyme Reference Certified Materials Służą do kalibracji wartości docelowych we wzorcach roboczych (dla zestawów odczynników) i materiałach kontrolnych Skomplikowana procedura przygotowania Wykazują spójność pomiarową z referencyjną procedurą (IFCC) i pierwszorzędowymi materiałami referencyjnymi Enzymy pochodzą z różnych źródeł, są trwałe i kompatybilne z materiałem ludzkim

Elementy standaryzacji oznaczeń enzymów Stosowanie zalecanych metod, szczegółowo opisanych. Temperatura 37°C. Stosowanie jednostek SI (katale). Stosowanie przez producentów do kalibracji metod co najmniej drugorzędowego wzorca aktywności enzymatycznej – zgodność z zalecaną metodą referencyjną (IFCC) i wzorcem pierwszorzędowym.

Główne enzymy mające znaczenie kliniczne Aminotransferaza asparaginianowa (AST, GOT) Aminotransferaza alaninowa (ALT, GPT) Kinaza kreatyny (CK) Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) Fosfataza alkaliczna (ALP) Kwaśna fosfataza (ACP) Enzymy dróg żółciowych (5’nukleotydaza, GGT) Enzymy trawienne (amylaza, lipaza, trypsyna, chymotrypsyna) Pseudocholinesteraza Dehydrogenaza G-6-P

Aminotransferazy – ALT, AST

Znaczenie kliniczne aminotransferaz WZROST AKTYWNOŚCI: 100x – ciężkie uszkodzenie wątroby 10-30x – ostre WZW 100-1000U/L autoimmunologiczne zapalenie wątroby 1,5-5x – marskość wątroby 2-3x – zastój w krążeniu wrotnym, cholestaza, przewlekłe choroby mięśni, ONN

Wskaźnik de Ritisa Jest to stosunek aktywności aminotransferazy asparaginowej do aminotransferazy alaninowej (AST/ALT) Prawidłowo: wkaźnik nieco >1 >2 – alkoholowe zapalenie wątroby <1 – ostre wirusowe zapalenie wątroby >1 – przewlekłe zapalenie wątroby >2 – zawał serca (2doba)

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) Enzym uczestniczący w beztlenowym metabolizmie glukozy (pirogronian → mleczan) W organizmie człowieka istnieją dwa łańcuchy polipeptydowe tego enzymu: H (heart) i M (muscle). Funkcjonalny enzym jest tetramerem i zawiera różne kombinacje wspomnianych podjednostek: LDH – 1 (HHHH) serce, erytrocyty LDH – 2 (HHHM) leukocyty LDH – 3 (HHMM) płuca LDH – 4 (HMMM) nerki, łożysko, trzustka LDH – 5 (MMMM) wątroba, mięśnie szkieletowe

Fosfataza alkaliczna (ALP) Enzym błonowy z klasy hydrolaz, katalizuje reakcję defosforylacji różnych estrów fosforanowych, optymalnie działa w środowisku zasadowym. W surowicy krwi pochodzi z następujących źródeł: frakcja kostna – produkowana przez osteoblasty, bierze udział w procesie mineralizacji kości frakcja wątrobowa – enzym zlokalizowany przede wszystkim w komórkach nabłonkowych kanalików żółciowych (wydalany z żółcią) frakcja jelitowa

Fosfataza kwaśna (ACP) Enzym z klasy hydrolaz, katalizuje reakcję defosforylacji estrów fosforanowych, optymalnie działa w środowisku kwaśnym Fosfataza kwaśna obecna w surowicy krwi ludzkiej, może pochodzić z następujących źródeł: osteoklasty‐ tzw. frakcja kostna gruczoł krokowy‐ tzw. frakcja sterczowa trzustka jelita nerki trombocyty i erytrocyty Dodanie L‐winianu hamuje kwaśną fosfatazę sterczową, nie działając na inne izoenzymy. Różnica między tymi dwoma oznaczeniami (całkowitą kwaśną fosfatazą oraz niesterczową kwaśną fosfatazą) daje poziom sterczowej kwaśnej fosfatazy.

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) wzrost aktywności we wczesnym okresie zawału mięśnia sercowego oraz przy nadmiernej hemolizie Kinaza fosfokreatyny (CK) wzrost aktywności frakcji CK-MB jest czułym wskaźnikiem martwicy zawałowej mięśnia sercowego Fosfataza alkaliczna (ALP) Marker cholestazy oraz schorzeń kości Gamma – glutamylotransferaza (GGT) Marker uszkodzenia alkoholowego wątroby Pseudocholinesteraza Spadek aktywności obserwuje się w chorobach przebiegających z uszkodzeniem miąższu wątroby

Typowe zmiany aktywności we krwi enzymów uwolnionych w wyniku zawału mięśnia sercowego

Diagnostyka chorób wątroby aminotransferaza asparaginianowa (AST)     aminotransferaza alaninowa (ALT) fosfataza alkaliczna (ALP) -glutamylotranspeptydaza (GGT) S-transferaza glutationowa Znaczenie diagnostyczne: wirusowe zapalenie wątroby, marskość wątroby, żółtaczka mechaniczna

Inne tkanki Mięsień sercowy kinaza kreatynowa, aminotransferaza asparaginianowa, dehydrogenaza mleczanowa (zawał mięśnia sercowego) Trzustka -amylaza, lipaza (ostre zapalenie trzustki) Prostata fosfataza kwaśna (rak prostaty) Mięśnie kinaza kreatyny, aldolaza, fosforylaza glikogenowa Kości fosfataza alkaliczna

Bilirubina to organiczny związek chemiczny, żółty barwnik – produkt degradacji części porfirynowej hemu (głównie hemoglobiny – 80%) i w mniejszym stopniu innych białek zawierających hem, np. mioglobiny, cytochromów P-450, katalazy.

Powstawanie bilirubiny hemoglobina hem globina Fe biliwerdyna aminokwasy pula Fe całkowitego bilirubina

Bilirubina występuje w dwóch formach: Wolna = pośrednia, połączona z albuminami, nierozpuszczalna w wodzie, nie może przenikać przez błonę podstawną kłębuszków nerkowych i przedostawać się do moczu; może natomiast przenikać przez barierę krew – mózg i w dużych stężeniach działać neurotokscznie. Związana = bezpośrednia = sprzężona = glukuronian bilirubiny, połączona z kwasem glukuronowym, nie łączy się z białkami krwi, dzięki czemu z łatwością przedostaje się przez błonę filtracyjną nefronu do moczu, jest rozpuszczalna w wodzie. Po sprzęgnięciu z kwasem glukuronowym traci zdolność przenikania bariery krew-mózg i przestaje być związkiem neurotoksycznym. Sprzęganie bilirubiny zachodzi w hepatocytach (enzym UDP – glukuronylo- transferaza).

Glukuronizacja bilirubiny

Metabolizm bilirubiny Bilirubina bezpośrednia (związana z kwasem glukuronowym) jest wydzielana przez wątrobę do żółci, a następnie przedostaje się do światła jelita, gdzie na skutek działania bakterii ulega utlenieniu do sterkobilinogenu. Sterkobilinogen wchłaniany jest częściowo w dalszej części przewodu pokarmowego z powrotem do krwi, skąd wychwytują go na nowo hepatocyty (tzw. krążenie jelitowo – wątrobowe bilirubiny). Kiedy wątroba nie jest w stanie przetworzyć całego dostarczanego sterkobilinogenu, na skutek uszkodzenia hepatocytów lub zbyt dużego napływu substratu, jego część przedostaje się do moczu jako urobilinogen.

wewnątrzkomórkowa bilirubina hemoglobina układ siateczkowo – śródbłonkowy wątroby, śledziony, szpiku kostnego bilirubina wolna krew bilirubina wolna wątroba wewnątrzkomórkowa bilirubina wątroba krew krążenia wrotnego bilirubina związana jelito – enzymy flory bakteryjnej sterkobilinogen = urobilinogen mocz kał urobilina sterkobilina

Hiperbilirubinemia jest to zwiększenie stężenia bilirubiny w osoczu Hiperbilirubinemia jest to zwiększenie stężenia bilirubiny w osoczu. Może być ona spowodowana: zwiększonym wytwarzaniem bilirubiny niezdolnością wydzielania bilirubiny powstającej w prawidłowych ilościach przez uszkodzoną wątrobę

Przyczyny hiperbilirubinemii Niesprzężona hiperbilirubinemia: Wzrost produkcji niesprzężonej bilirubiny z hemu Hemoliza Nieefektywna erytropoeza Szybki katabolizm masy czerwonych krwinek (noworodki) Zmniejszone dostarczanie niesprzężonej bilirubiny do wątroby Prawostronna zastoinowa niedomoga serca Przetoka żylna wrotno - próżna Zmniejszony wychwyt niesprzężonej bilirubiny przez błonę hepatocyta Hamowanie niekompetycyjne (leki) Zmniejszone przechowywanie niesprzężonej bilirubiny w cytozolu (spadek białek Y i Z)

Sprzężona hiperbilirubinemia: Obniżone wydzielanie sprzężonej bilirubiny do kanalików: Dysfunkcje komórek wątroby Zapalenie wątroby Cholestaza wewnątrzwątrobowa Zespół Dubina – Johnsona Leki (estradiol) Obniżony przepływ żółci Kamienie żółciowe Rak przewodów żółciowych Zwężenie przewodów żółciowych Niedrożność przewodów żółciowych Pierwotne stwardniające zapalenie przewodów żółciowych Niedrożność wewnątrzwątrobowa Niektóre leki Ziarnica złośliwa Pierwotna marskość wątroby Guz wątroby

Zaburzone sprzęganie bilirubiny: Żółtaczka noworodkowa Hamowanie sprzęgania bilirubiny Dziedziczne (zespół Criglera-Najjara) Typ I (całkowity niedobór UDP – glukuronylo-transferazy) Typ II (częściowy niedobór enzymu) Dysfunkcja hepatocyta

Metody oznaczania bilirubiny

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) pozwala rozdzielić bilirubinę na 4 frakcje: alfa – frakcja bilirubiny wolnej – 27% (8 – 55%) beta – frakcja bilirubiny sprzężonej (monoglukuronid bilirubiny) – 24% (8 – 37%) gamma – frakcja bilirubiny sprzężonej (diglukuronid bilirubiny) – 13% (7 – 21%) delta - frakcja bilirubiny sprzężonej, związanej kowalencyjnie z albuminami; nie występuje u osób zdrowych i pojawia się przy wysokich, utrzymujących się stężeniach bilirubiny sprzężonej – 37% (1 – 77%) Metoda HPLC nie ma szerokiego zastosowania w rutynowej diagnostyce.

Metoda z odczynnikiem dwuazowym (reakcja Ehrlicha) Glukuronian bilirubiny ulega sprzęgnięciu z solą dwuazoniową kwasu sulfanilowego tworząc barwna pochodną – azobilirubinę. Glukuronian bilirubiny jest związkiem rozpuszczalnym w wodzie, dlatego wchodzi w reakcję bezpośrednio. Metoda pozwala na pomiar tylko bilirubiny sprzężonej.

Metoda van der Bergha Reakcja z odczynnikiem dwuazowym Ehrlicha (jw.). Pozwala określić kolorymetrycznie stężenie bilirubiny sprzężonej oraz całkowitej. Rozpuszczalny w wodzie glukuronian bilirubiny wchodzi w reakcję bezpośrednio, natomiast bilirubina związana z albuminą wymaga wcześniejszej hydrolizy (dodatek metanolu). Frakcję pośrednią (wolną) wyliczano z różnicy bilirubiny całkowitej i bezpośredniej.

Metoda Jendrassika – Grofa Modyfikacja metody van ber Bergha. Zamiast alkoholu stosuje się kofeinę i benzoesan sodu, w obecności których bilirubina dysocjuje od albumin. Bezpośredni pomiar spektrofotometryczny w surowicy z krwi kapilarnej przy 454 nm. Brak we krwi karotenów, które mogłyby interferować. Bezpośredni pomiar we krwi noworodków

Bilirubinometr Urządzenie do nieinwazyjnego przeskórnego pomiaru poziomu bilirubiny, również w czasie i po fototerapii noworodków. Na pomiar nie ma wpływu płeć, wiek urodzeniowy, rasa ani waga noworodka. Dokonuje pomiaru przez kierowanie białego światła w skórę noworodka i bada intensywność powracających fal o określonej długości. Znając spektralne właściwości składników skóry, można wydzielić składniki zakłócające i określające koncentrację bilirubiny.

Bilirubina w moczu Testy paskowe Świeża próbka moczu (ekspozycja na światło → rozpad) Kwas askorbinowy i azotyny – wyniki fałszywie ujemne

Normy Bilirubina całkowita: 0,2 – 1,0 mg/dl (3 – 17 μmol/l) Bilirubina sprzężona: 0,0 – 0,2 mg/dl (0 – 3 μmol/l) Bilirubina niesprzężona: 0,2 – 0,8 mg/dl (3 – 14 μmol/l) Bilirubina całkowita – noworodki <12 mg/dl (205 μmol/l)

Dziękuję za uwagę 