Lupinus angustifolius Biblioteka BAC genomu Lupinus angustifolius Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej prof. dr hab. Bogdan Wolko

Cel pracy Konstrukcja biblioteki BAC dla genomu Lupinus angustifolius Charakterystyka biblioteki – czystość, średnia wielkość insertu, reprezentatywność Wykorzystanie biblioteki – przeszukiwanie sondami EST, chromosome painting, chromosome walking

Materiały DNA Lupinus angustifolius, izolowany z jąder interfazowych stożków wzrostu korzeni, oczyszczony metodą cytometrii przepływowej Enzym restrykcyjny HindIII Wektor pINDIGOBAC5 (Epicentre) Komórki kompetentne E. coli DH10B Medium selekcyjne (CHl, X-Gal, IPTG) Płytki do przechowywania klonów w temperaturze -80oC, 384-miejscowe

„sortera chromosomów” Detektor Źródło światła Naładowana elektroda Selekcjonująca krople Zanieczyszczenia Frakcja o ładunku dodatnim ujemnym + _ Puls ładujący próbkę Próbka 1. Izolacja DNA za pomocą „sortera chromosomów”

2. Trawienie DNA w niskotopliwej agarozie (HindIII, 15min, 37°C) 3 2. Trawienie DNA w niskotopliwej agarozie (HindIII, 15min, 37°C) 3. Selekcja wielkości fragmentów po trawieniu PFGE: Podwójna selekcja wielkości (w buforze 0. 25 x TBE) Pierwsza selekcja: 1% żel agarozowy, 1s - 40s, 6h, 6V/cm, kąt 120° Druga selekcja: 1% żel agarozowy, 2.5s - 4.5s, 12h, 6V/cm, kąt 120°

4. Elektroelucja (1,5 h, 1xTAE, 4 V/cm, 4oC) 5. Ligacja z wektorem pIndigoBAC-5 (Epicentre)

Płyta typu BioAssay z transformowanymi komórkami bakteryjnymi 6. Transformacja E. coli DH10B (350 V, impuls 4000, 330 F) 7. Selekcja klonów na podłożu stałym z chloramfenikolem, X-gal, IPTG Płyta typu BioAssay z transformowanymi komórkami bakteryjnymi

8. Pikowanie i inokulacja (GeneTAC G3)

9. Sprawdzenie średniej długości insertów - trawienie BAC’ów enzymem NotI - elektroforeza w pulsującym polu (1% żel agarozowy, 0,5xTBE , 1s - 40s, 16h, 6V/cm, kąt 120°)

Dystrybucja wielkości insertów Procentowy udział w bibliotece Długość insertu [kbp]

- wzór Clarke’a i Carbona Obliczanie prawdopodobieństwa znalezienia dowolnie wybranej sekwencji nukleotydowej genu w bibliotece BAC - wzór Clarke’a i Carbona P - prawdopodobieństwo, że dowolna sekwencja genomowa ma odpowiednik w bibliotece N - liczba klonów (55 296) x - średnia długość insertu (100 kpz) y - wielkość genomu (920 Mpz)

Klucz odczytywania sygnałów 10. Test czystości biblioteki – hybrydyzacja z sondami specyficznymi dla mtDNA i cpDNA łubinu Klucz odczytywania sygnałów Przykładowa hybrydyzacja z sondą mtDNA Dwa pozytywne sygnały na 18 432 klony BAC

12. Hybrydyzacja in situ wyselekcjonowanego klonu BAC 11. Screening biblioteki sondami EST znakowanymi radioaktywnie – poszukiwanie genu ENOD40 12. Hybrydyzacja in situ wyselekcjonowanego klonu BAC

Podsumowanie Skonstruowano pierwszą bibliotekę BAC dla genomu Lupinus angustifolius Charakterystyka biblioteki: - liczba klonów: 55 296 - średnia wielkość insertu: 100 kbp - zanieczyszczenie mtDNA: 0,018% - zanieczyszczenie cpDNA: 0,045% - prawdopodobieństwo znalezienia sekwencji: 99,7% - pokrycie: 6x