Promotor: Dr hab. n. med. Jerzy Mackiewicz Uniwersytet Medyczny w Lublinie Katedra i Klinika Okulistyki Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tomasz Żarnowski Monika Jasielska Rola receptora czynnika martwicy guza α Rp75 (TNFRp75) w powstawaniu neowaskularyzacji naczyniówkowej Promotor: Dr hab. n. med. Jerzy Mackiewicz  Lublin 2010

Neowaskularyzacja naczyniówkowa (choroidal neovascularization – CNV) rozrost małych naczyń pochodzących z naczyń włosowatych naczyniówki, które poprzez błonę Brucha przedostają się do przestrzeni pod nabłonkiem barwnikowym siatkówki, jak i w obręb komórek nabłonka barwnikowego siatkówki i fotoreceptorów; patologiczne naczynia są niepełnowartościowe, mniej wytrzymałe, bardziej kruche i mają kręty przebieg; nieszczelność nowo powstałych naczyń skutkuje przeciekiem płynu lub krwi, które, kumulując się w przestrzeni podsiatkówkowej, powodują surowicze lub krwotoczne odwarstwienie nabłonka barwnikowego siatkówki; prowadzi do powstania tarczowatej, włóknistonaczyniowej blizny

Neowaskularyzacja naczyniówkowa Schorzenia występujące z neowaskularyzacją naczyniówkową Zwyrodnieniowe Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem Zwyrodnienie krótkowzroczne Pasma naczyniaste Genetycznie uwarunkowane Dystrofia żółtkowata plamki Dno żółtoplamiste Druzy tarczy nerwu wzrokowego Zapalne Zespół histoplazmozy ocznej Wieloogniskowe zapalenie naczyniówki Pełzające choroiditis Toksoplazmoza Toksokaroza Różyczka Zespół Vogta-Kayanagi-Harady Zespół Behçeta Zapalenie współczulne Guzy Znamię naczyniówki Naczyniak naczyniówki Guzy przerzutowe naczyniówki Hamartoma nabłonka barwnikowego siatkówki Urazowe Pęknięcie naczyniówki Intensywna fotokoagulacja Idiopatyczne

Neowaskularyzacja naczyniówkowa Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (age-related macular degeneration – AMD) to degeneracyjna choroba oczu, która jest najczęstszą przyczyną poważnego upośledzenia widzenia u osób po 50. roku życia w krajach rozwiniętych. Istotą tego schorzenia jest pojawienie się zmian w centralnej części siatkówki, w plamce żółtej, która odpowiada za widzenie centralne. Choroba ta prowadzi do ograniczenia w znacznym stopniu zdolności wykonywania codziennych podstawowych czynności (np. czytania, prowadzenia samochodu). AMD w znacznym stopniu obniża jakość życia, skazuje osoby dotychczas samodzielne na opiekę osób trzecich oraz często w znacznym stopniu obciąża ekonomicznie pacjenta i jego rodzinę. W ostatnich latach obserwujemy stale rosnącą, liczbę chorych na AMD, co jest związane z procesem starzenia się społeczeństw i powoduje występowanie chorób typowych dla wieku podeszłego (w tym AMD) na skalę epidemiczną. Przypadki zachorowań na AMD szacuje się na 2-10% u osób powyżej 50. roku życia i ponad 13% – po 85. roku życia. Szacuje się, że liczba chorych w ciągu najbliższych 25 lat wzrośnie trzykrotnie. Można zatem uznać, że w przypadku AMD mamy do czynienia z chorobą społeczną.

Koncepcje powstawania CNV zaburzenie równowagi pomiędzy czynnikami proangiogennymi (czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (vascular endothelial growth factor; VEGF), czynnik wzrostu fibroblastów (fibroblast growth factor; FGF), płytkopochodny czynnik wzrostu (plateled-derived growth factor; PDGF), czynnik martwicy guza α (tumor necrosis factor α; TNFα) i antyangiogennymi (czynnik pochodzący z nabłonka barwnikowego siatkówki (pigment epithelium derived factor – PEDF), angiostatyna, endostatyna) rola hipoksji, niedokrwienia, procesu zapalnego; zaburzenie funkcji nabłonka barwnikowego siatkówki; dysfunkcja naczyń włosowatych naczyniówki Miller D.W.et al. 2003

Laserowy model CNV Indukowanie energią lasera pęknięć w błonie Brucha w celu inicjacji neowaskularyzacji naczyniówkowej, której towarzyszy niespecyficzna, lokalna reakcja zapalna. Nabłonek barwnikowy siatkówki Błona Brucha Naczynie włosowate naczyniówki CNV

Czynnik martwicy guza α (TNFα) czynnik martwicy nowotworów, kachektyna, inicjujący czynnik różnicujący (differention-inducing factor - DIF) plejotropowa cytokina prozapalna, regulująca różnicowanie i wzrost komórek; wyizolowany po raz pierwszy w 1975 roku jako czynnik odpowiedzialny za martwicę mięsaka myszy; trimeryczne białko kodowane przez gen X02910/X02159 w segmencie 6p23-6q12 na chromosomie 6; u osób dorosłych ekspresja tego genu, charakterystyczna przede wszystkim dla makrofagów i monocytów, a w mniejszym stopniu dla komórek NK, limfocytów, neutrofilii, komórek tucznych, fibroblastów, keratynocytów, adipocytów; występuje w formie rozpuszczalnej (17 kD) i transbłonowej (27 kD)

Czynnik martwicy guza α (TNFα) długotrwałe wydzielanie TNFα, indukującego lipolizę oraz pobudzającego wydzielanie hormonów katabolicznych, prowadzi do kacheksji wpływ na komórki układu odpornościowego oraz uczestniczące w regulacji reakcji immunologicznej powoduje martwicę pewnych typów nowotworów, ale również promuje wzrost innych typów komórek nowotworowych białko ostrej fazy, które inicjuje aktywację kaskady cytokin i zwiększa przepuszczalność naczyń, rekrutuje makrofagi i neutrofile do miejsca zapalenia częściowo odpowiedzialny za insulinooporność TNFα niskie stężenie TNFα pomocne w utrzymaniu zrównoważonego dobowego rytmu ciała odpowiedzialny za powstawanie zmian miażdżycowych i niewydolności krążenia, zapalenie trzustki oraz alkoholowe uszkodzenie wątroby udział w schorzeniach autoimmunizacyjnych, w odrzucaniu przeszczepów, w reakcji przeszczep przeciw gospodarzowi oraz w przebiegu AIDS

TNFα w powstawaniu CNV TNFα Ekspresja VEGF przez komórki nabłonka barwnikowego siatkówki Ekspresja białek adhezyjnych (tj.: ICAM-1, VCAM, CD18) przez komórki śródbłonka i leukocyty Aktywacja białek jądrowego czynnika kappa B (NFκB)

Receptory czynnika martwicy guza α Receptor TNFRp55 (TNFRβ, p55, CD120α) Receptor TNFRp75 (NFR2, TNFRα bądź CD120β) masa cząsteczki 55 kDa masa cząsteczki 75 kDa występuje na większości komórek jądrzastych występuje przede wszystkim na leukocytach oraz komórkach śródbłonka wiąże formę błonową i rozpuszczalną TNFα wiąże głównie formę transbłonową TNFα wewnątrzkomórkowy fragment - domena śmierci (death domain – DD) odpowiedzialny za mechanizmy komórkowe prowadzące do aktywacji kaspaz i apoptozy część cytoplazmatyczna wiąże się bezpośrednio z białkami adaptorowymi - TRAF1 i TRAF2 - które łączą się z różnymi białkami uczestniczącymi w przekazywaniu sygnałów zaangażowany w apoptozę i aktywację jądrowego czynnika kappa B (NFκB) aktywacja (przez receptor TNFRp75) jądrowego czynnika kappa B (NFκB) w komórkach śródbłonka stymuluje ekspresję genów antyapoptozy i wzrost przeżywalności komórek śródbłonka; niezbędny dla ekspresji genów VEGF związanych z NFκB aktywacja TNFRp55: powstanie procesu zapalnego, zahamowanie migracji komórek śródbłonka, apoptoza komórek śródbłonka wpływa na proliferację limfocytów, promuje aktywację komórek śródbłonka, ich migrację i przeżycie poprzez aktywację specyficznej mu kinazy Etk/Bmx, która bierze udział w migracji komórek śródbłonka i tworzeniu naczyń in vitro

Cel pracy ocena angiogennej aktywności czynnika martwicy guza α (TNFα) określenie roli receptorów TNFα: TNFRp55 i TNFRp75 w powstawaniu neowaskularyzacji naczyniówkowej

Materiał i metody myszy linii C57/BL6 (szczep dziki; ang. wild type, WT) - grupa referencyjna (n=10, 20 oczu) myszy transgeniczne - knockout względem receptora TNFRp55 (TNFRp55-/-) (n=10, 20 oczu) myszy transgeniczne - knockout względem receptora TNFRp75 (TNFRp75-/-) (n=10, 20 oczu)

Materiał i metody Fotokoagulacja laserowa: aplikacja wokół tarczy nerwu wzrokowego każdego oka pięciu ognisk laserowych o mocy 120 mW, średnicy 50 µm, czasie 100 ms

Materiał i metody Angiografia fluoresceinowa 14 dni po fotokoagulacji laserowej Klasyfikacja przecieku fluoresceiny w angiografii fluoresceinowej myszy (wg Semkova) Brak przecieku: + Nieznaczna hiperfluorescencja, bez przecieku czy wzrostu wielkości i intensywności. Nieznaczne uszkodzenie tkanek. Przeciek: ++ Hiperfluorescencja o wzrastającej intensywności, ale bez wzrostu wielkości. Umiarkowane uszkodzenie tkanek. Przeciek: +++ Hiperfluorescencja, wykazująca wzrost wielkości i intensywności w trakcie badania. Poważne uszkodzenie tkanek. Przeciek: ++++ Zlewające się i powiększające się obszary hyperfluorescencji. Siatkówka prawie całkowicie objęta przeciekiem. Często występująca trudność odróżnienia pojedynczego ogniska. Bardzo poważne uszkodzenie tkanek.

Materiał i metody Ocena histologiczna: Preparaty płaskie Barwienie histochemiczne z izolektyną – ocena unaczynienia Barwienie immunohistochemiczne z izolektyną i markerem makrofagów F4/80 – wizualizacja naczyń i komórek zapalnych Preparaty parafinowe Barwienie hematoksyliną i eozyną – ocena struktury siatkówki i naczyniówki Barwienie immunohistochemiczne z czynnikiem von Willebrandta i z przeciwciałami anty-F4/80 - wizualizacja naczyń i komórek zapalnych Barwienie immunohistochemiczne przeciwciałem anty‑Bmx – ocena proliferacji komórek Barwienie TUNEL – detekcja apoptozy komórek

Materiał i metody Analiza Western blot Ocena ekspresji białek czynnika martwicy guza α Ocena ekspresji białek kaspazy 3 i kaspazy 8

Wyniki Ekspresja TNFα w nabłonku barwnikowym siatkówki i w naczyniówce myszy linii C57/BL6, TNFRp55-/- i TNFRp75-/-, poddanych dzień wcześniej i dwa tygodnie wcześniej fotokoagulacji laserowej (+) i myszy nielaserowanych (-). 1 dzień po fotokoagulacji 2 tygodnie po fotokoagulacji

Wyniki Angiografia fluoresceinowa

Wyniki A.Ogniska neowaskularyzacji naczyniówkowej obserwowane 14 dni po fotokoagulacji laserowej myszy TNFRp55-/- , TNFRp75-/- i myszy C57/BL6 w preparatach płaskich barwionych izolektyną IB4. Powiększenie 20x. B. Kwantyfikacja wielkości ognisk neowaskularyzacji naczyniówkowej (Qm2) w preparatach płaskich barwionych izolektyną.

Wyniki A. Ogniska neowaskularyzacji naczyniówkowej w preparatach płaskich myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6 – nałożone obrazy podwójnego barwienia izolektyną IB4 oraz przeciwciałami anty-F4/80. Powiększenie 20x. B. Powierzchnia ogniska neowaskularyzacji naczyniówkowej zajmowana przez F4/80-dodatnie komórki (wyrażona w % powierzchni ogniska). C. Powierzchnia zajmowana przez makrofagi poza granicami ognisk lasera.

Wyniki Ogniska neowaskularyzacji naczyniówkowej w preparatach myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6 14 dni po zastosowaniu energii lasera argonowego. Powiększenie 20x. Barwienia H+E, czynnikiem von Willebrandta, przeciwciałem anty-F4/80.

Wyniki Ekspresja białek kaspazy 3 i kaspazy 8 w nabłonku barwnikowym siatkówki i naczyniówce myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6 tydzień po fotokoagulacji laserowej w analizie Western blot. Wyniki analizy densytometrycznej ekspresji kaspazy 3 i kaspazy 8 trzech prążków trzech różnych badań (±SEM).

Wyniki Wyniki barwienia TUNEL oraz DAPI preparatów parafinowych siatkówki i naczyniówki myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6 dwa tygodnie po fotokoagulacji laserowej. Powiększenie 20x.

Wnioski Receptory czynnika martwicy guza α: TNFRp55 i TNFRp75 biorą udział w patomechanizmie powstawania neowaskularyzacji naczyniówkowej po laserowej fotokoagulacji u myszy. W przebiegu neowaskularyzacji naczyniówkowej interakcje czynnika martwicy guza α z receptorami TNFRp55 i TNFRp75 aktywują dwie odmienne drogi, z których pierwsza prowadzi do apoptozy, a druga do proliferacji i migracji komórek śródbłonka naczyń. Wyłączenie funkcji receptora TNFRp75 może skutkować zmniejszeniem procesu zapalnego oraz ograniczeniem powierzchni neowaskularyzacji naczyniówkowej, a tym samym mniejszym uszkodzeniem tkanek u chorych z objawową neowaskularyzacją naczyniówkową. Przedstawione dowody wskazują na potencjalne możliwości leczenia neowaskularyzacji naczyniówkowej, wykorzystujące wiedzę na temat roli receptorów TNFRp55 i TNFRp75 w powstawaniu neowaskularyzacji naczyniówkowej.

Ze względu na wzrastającą liczbę osób w wieku podeszłym i rozpoznawanie u nich nowych, dotychczas nieznanych chorób narządu wzroku, konieczne jest nasilenie opieki okulistycznej w środowisku życia tych osób. Należy dołożyć wszelkich starań, aby poprawić jakość życia pacjentów dotkniętych AMD oraz zmniejszyć ekonomiczne i społeczne koszty inwalidztwa wzrokowego znacznego odsetka społeczeństwa.

Dziękuję

Promotor: Dr hab. n. med. Jerzy Mackiewicz Uniwersytet Medyczny w Lublinie Katedra i Klinika Okulistyki Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tomasz Żarnowski Monika Jasielska Rola receptora czynnika martwicy guza α Rp75 (TNFRp75) w powstawaniu neowaskularyzacji naczyniówkowej Promotor: Dr hab. n. med. Jerzy Mackiewicz  Lublin 2010