BADANIE DZIAŁANIA IZOTIOCYJANIANÓW NA KOMÓRKI LUDZKIE Joanna Biedrzycka Kierownik pracy: prof. dr hab. Teresa Kasprzycka-Guttman, Opiekun pracy: dr inż. Irena Misiewicz-Krzemińska, Narodowy Instytut Leków, Warszawa w Wprowadzenie Izotiocyjaniany (ITC) są grupą związków biologicznie czynnych występujących głównie w warzywach z rodziny krzyżowych m.in. brokułach, kapuście, brukse-lce, kalafiorze i innych. Zarówno in vivo, jak i in vitro wykazują one silne właściwości chemoprewentywne. Izotiocyjaniany indukują aktywność enzymów 2 fazy metabolizmu w organizmie. Enzymy te chronią komórki przed toksycznymi efektami działania elektrofili i reaktywnych form tlenu (RFT). Jednym z enzymów należących do 2 fazy jest transferaza S-glutationowa (GST). Glutation jest wewnatrzkomórkowym trój-peptydem - -GluCysGly (GSH), który bierze udział w procesach detoksykacji organizmów. Wykazano, że ITC kumulują się w komórkach głównie w postaci ko-niugatów z glutationem, Reakcja ta katalizowana jest przez transferazę S-glutationową. Celem pracy było badanie zmian poziomu glutationu (GSH) i aktywności GST pod wpływem działania trzech ITC: sulforafanu, alyssinu oraz izoticyjanianu 2-oksoheksylu. Badania prowadzono na komórkach o normalnym i obniżonym poziomie glutationu. Czynnikiem obniżajacym poziom GSH jest BSO (butioninosulfoksy-imina), który jest selektywnym inhibitorem syntezy glutationu. Sprawdzano także czy izotiocyjanian 2-oksoheksylu i alyssin działają poprzez ten sam mechanizm molekularny co sulforafan. Sulforafan wpływa na translo-kację białka Nrf2 do jądra komórowego. Tam białko to wiaże się ze składnikami odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE), które są odpowiedzialne za aktywację genów kodujących enzymy 2 fazy. MATERIAŁY DO BADAŃ 4-metylosulfinylo n-butyl (Sulforafan) CH3-SO-(CH2)4-NCS Izotiocyjanian 2-oksoheksylu CH3-CO-(CH2)4-NCS 5-metylosulfinylo n-amyl (Alyssin) CH3-SO-(CH2)5-NCS Ludzkie komórki białaczki Zdrowe limfoblastoidy ludzkie ILOŚĆ REAKTYWNYCH FORM TLENU WPŁYW IZOTIOCYJANIANÓW NA AKTYWNOŚĆ GST Zdrowe limfoblastoidy ludzkie Ludzkie komórki białaczki CCRF-SB Próba kontrolna Próba z BSO Wraz ze wzrostem natężenia fluorescencji rośnie ilość RFT A B C D SFN – Sulforafan SFC – Izotiocyjanian 2-oksoheksylu ALL - Alyssin Zdrowe limfoblastoidy ludzkie Ludzkie komórki białaczki CCRF-SB E G H METODYKA BADAŃ F W celu zbadania mechanizmu działania ITC wykonano następujace badania: Zbadano zmiany aktywności enzymatycznej GST dla zdrowych limfoblastoidów ludzkich oraz CCRF-SB z zastosowaniem 1-chloro-2,4-dinitrobenzenu (CDNB) jako substratu ( po inkubacji linii komórkowych z ITC, BSO oraz ich mieszaniną) Jednocześnie zbadano ilość reaktywnych form tlenu metodą cytometrii przepływowej z zastosowaniem dihydrorodaminy (DHR123) jako barwnika Mechanizm regulacji aktywności enzymów, przedstawiony na schemacie, badano przy użyciu mikroskopu konfokalnego z wykorzystaniem przeciwciał skierowanych przeciwko białkom Keap1 i Nfr2 oraz odpowiednich barwników fluorescencyjnych Wnioski Obecność BSO w obu liniach komórkowych po czasie inkubacji 24h powoduje spadek aktywności GST, co wskazuje na niski poziom glutationu (Tabela 1) BSO wpływa na zwiększenie ilości szkodliwych dla organizmu RFT (Rysunek A, B, C, D) Aktywność GST rośnie wraz ze wzrostem stężenia izotiocyjanianów i wydłużaniem czasu inkubacji (Rysunek E, F, G, H) Aktywność GST jest silniej indukowana przez ITC w komórkach ludzkiej białaczki (G, H) Alyssin najsilniej indukuje enzym GST Badania wstępne sugerują, że izotiocyjaniany działają poprzez ten sam mechanizm molekularny co sulforafan WPŁYW BSO NA ZMIANY AKTYWNOŚCI ENZYMU GST Tabela 1 Czas inkubacji LIMFOBLASTOIDY CCRF-SB KONTROLA + BSO aktywność GST [mol/ml/min] 24h 7,90 ± 0,69 5,79 ± 0,49 7,52 ± 0,68 6.80 ± 0.63 48h 7,97 ± 0,75 5,29 ± 0,72 7,50 ± 0,68 7,72 ± 0,53 Induktor - sulforafan Keap 1 – Nrf2 – kompleks pomiędzy białkiem związanym z aktyną Keap1 a czynnikiem transkrypcyjnym Nrf2 ARE – składniki odpowiedzi anty- oksydacyjnej