Agata Granis KONSTRUKCJA I WŁAŚCIWOŚCI BIOCZUJNKA AMPEROMETRYCZNEGO Z UNIERUCHOMIONĄ OKSYDAZĄ ARYLOALKOHOLOWĄ Pracownia Analizy Przepływowej i Chromatografii Kierownik pracy: prof. dr Marek Trojanowicz, Opiekun: dr Ewa Poboży Agata Granis Praca wykonana częściowo na Uniwersytetcie w Alcala(Hiszpania) w ramach stażu ERASMUS pod kierunkiem prof.dr E. Dominguez Mechanizm działania bioczujnika Cel pracy Rodzielanie substratów AAO Celem pracy było skonstruowanie bioczujnika amperometrycz-nego z unieruchominą oksydazą aryloalkoholową (AAO) do oznaczania zawartości alkoholi aromatycznych. Optymalizowano procedurę przygotowania elektrody oraz parametry jej zasto-sowania w pomiarach stacjonarnych i przepływowych. Właści-wości katalityczne oksydazy zastosowanej w elektrodzie pastowej lącznie z peroksydazą chrzanową (HRP) i mediatorem transpor-tu elektronów umożliwiły oznaczenie zawartości alkoholi aromatycznych w próbkach rzeczywistych na poziomie mikro-molowym z limitem detekcji dla alkoholu anyżowego 5 mol/l. Opracowany bioczujnik zastosowano również do pomiarów w układzie analizy przepływowo-wstrzykowej (FIA) a wyniki oznaczeń bioczujnikowych alkoholi aromatycznych w szeregu napojów porównywano z oznaczeniami metodą HPLC. H2O2 Aldehyd aromatyczny Alkohol (ox) Oksydaza Aryloalkoholowa O2 (red) Peroksydaza chrzanowa (ox) Peroksydaza H2O Os (III) e- (red) Oksydaza Os (II) Celem tego etapu była identyfikacja poszczególnych alkoholi aromatycznych w napojach. Zoptymalizowano procedurę rozdzielenia mieszaniny 7 wzorców (rodzaj i skład eluentu, długość fali, przepływ). Następnie w zoptymalizowanych warunkach do układu HPLC wstrzykiwano próbki napojów i na podstawie czasów retencji identyfikowano zawarte w nich składniki. benzylowy anyżowy 3,4 dimetoksybenzylowy 3-hydroksy 4-metoksybenzylowy 4- hydroksy 3-metoksy cynamonowy wanilinowy Porównanie elektrod pracujących o różnym składzie Sześciokanałowe naczynko pomiarowe o radialnym, cienkowarstwowym przepływie, pozwala na badania powtarzalności oznaczenia (jeżeli użyjemy jednakowych elektrod ) albo na kontrolowanie wpływu matrycy (jeżeli elektrody będą się różniły składem pasty). Sześć elektrod pracujących i elektroda odniesienia znajduje się w górnej części naczynka. Wlot i 6 otworów wyloto-wych dla każdej elektrody są w dolnej części. Układ radialny elektrod, które są w jednakowej odległości od wlotu zapewnia laminarny i identyczny dla wszystkich charakter przepływu. 250.0 500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0 -7 -0.200x10 -0.100x10 0.100x10 0.200x10 0.300x10 0.400x10 0.500x10 0.600x10 0.700x10 t / s i / A AAO HRP PVP CP HRP PVP CP PVP CP CP 1. Alk. 3-hydroksy 4-metoksybenzylowy (1 ppm) 2. Alk. 3,4 dimetoksybenzylowy (2 ppm) 3. Alk. Anyżowy (5 ppm) 4. Alk. 3- hydroksy 4-metoksy cynamonowy ( 1 ppm) 5. Alk. 3-metoksybenzylowy (5ppm) 6. Alk.benzylowy (10 ppm) 7. Trans, trans 2,4 heksadien 1-ol (10ppm) Czułość bioczujnika na różne substraty Zastosowana elektroda pastowa jest elektrodą dyskową o średnicy 0,85 mm. Unieruchomienie składników w paście pozwala dobierać propor-cje i skład pasty bioczujnika w dowolny sposób. Pasta bioczujnika AAO HRP PVP CP zawiera: 50 mg grafitu, 250 µl roztworu AAO (267U/ml), 5 mg HRP (263U/mg), 5mg PVPOs oraz 20 µl oleju parafinowego. Chromatogram mieszaniny wzorców alkoholi aromatycznych Kolumna: Phenomenex Luna C18; detektor UV Waters 2487; λ= 210 nm; Eluent MeOH/ H2O (75/25); F= 1 ml/min Elektody pracujące: AAO HRP PVP CP, HRP PVP CP, PVP CP, CP ( nazwy wg kolorów) Elektroda odsniesienia: Ag/AgCl sat; Elektroda pomocnicza: Pt E: -100mV Prędkość przepływu 1 ml*min-1; objętość wstrzykiwanej próbki: 20 μl; stężenie wstrzykiwanej próbki 10 mmol*l-1 Eluent: 0,1 mol*l-1 bufor cytrynowo- fosforanowy o pH 4 –4,1 mA/M Oznaczenia w próbkach napojów Z uwagi na możliwość wystąpienia interferencji od matrycy, próbki rze-czywiste monitorowano używając 6 elektrod jednocześnie. Trzy z nich były kompletnymi bioczujnikami, tzn. zawierały AAO, HRP i PVPOs, elektroda nr.4 miała w sobie tylko HRP i PVPOs, nr. 5 tylko PVP, a nr.6 była grafitową elektrodą grafitową bez żadnych dodatków. FIA HPLC Rodzaj próbki Obecność alkoholi Pacharan - Anis Bacardi Soberano Martini + Magno (whisky) Lanas Wódka Wino Przeprowadzono oznaczenia szeregu próbek rzeczywistych napoi.. rejestracje dla kilku rodzajów Listę Jedynym z badanych napoi, w którym występują alkohole aromatyczne okazało się Martini. Było to Martini Rosso wyprodukowane przez Martini & Rossi, numer partii 8 1499 1101 1.   Chromatograficznym oznaczeniom jakościowym poddane zostały vermuty Martini Bianco, Martini Rosso, oraz Ciociosan oraz próbka szampana. Wyniki ( z wyjątkiem Martini) wskazują na nieoobecność dodatków aromatyzujących w postaci alkoholi w tych napojach. Martini zawiera alkohol 3-hydroksy 4-metoksycynamonowy. Optymalizacja pracy bioczujnika w układzie przepływowym Wzorzec (C= 1ppm) Alk. 3-hydroksy 4- metoksy cynamonowy w Martinii Martinii+ wzorzec Elektroda pracująca: AAO/HRP/PVPOs CP,  Potencjał: -100 mV vs Ag/AgCl, Elektrolit: 0,1M bufor cytrynowo-fosforanowy pH 4, elektroda pomocnicza:Pt, elektroda odniesieniaAg/AgCl Wybór mediatora 250.0 500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0 -8 -0.800x10 -0.550x10 -0.300x10 -0.050x10 0.200x10 t / s i / A Sygnały uzyskane dla alkoholu anyżowego 250.0 500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0 -5 -0.150x10 -0.125x10 -0.100x10 -0.075x10 -0.050x10 -0.025x10 t / s i / A 10 mM Oksydaza AAO katalizuje reakcje utleniania kilku alkoholi aromatycznych. Skonstruowany bioczujnik jest najbardziej czuły na alkohol anyżowey, benzylowy i 2-naftalenometanol Centrum aktywne HRP jest głęboko ukryte pod łańcuchami bialkowymi i transport elektronów wymaga użycia mediatora. Zastosowanie kompleksu osmowego powoduje wzrost czułości o 3 rzędy wielkości oraz dwukrotne skrócenie czasu odpowiedzi. 5 mM 10 mM 2,5 mM 1 mM 5 mM Odpowiedź bioczujnika dla próbki Martini 3 sygnały od nieznanego alkoholu aromatycznego Bez mediatora Z mediatorem Identyfikacja nieznanego alkoholu aromatycznego w próbce Martini na podstawie chromatogramu Detekcja w warunkach FIA Wpływ szybkości przepływu Wpływ pH Stabilność Zakres liniowej odpowiedzi bioczujnika Amperogram dla alkoholu anyżowego Wnioski Unieruchomienie oksydazy aryloalkoholowej w paście grafitowej umożliwia otrzymanie stabilnego i czułego bioczujnika amperometrycznego do pomiarów stężeń alkoholi aromatycznych 2. Zastosowanie kompleksu osmu (II) jako mediatora umożliwia detekcję przy niskich potencjałach i zapewnia dobre właściwości dynamiczne elektrody Opracowany bioczujnik umożliwia oznaczanie całkowitej zawartości alkoholi aromatycznych w próbkach rzeczywistych. Ich identyfikacja wymaga zastosowania metod chromatograficznych   WE: modyfikowana enzymatyczna elektroda pastowa z oksydazą alkoholi aromatycznych: CP/PVPOs/HRP/AAO; RE:Ag/AgCl; CE: Pt, Nośnik: 0,1 mol*l-1 bufor cytrynowo fosforanowy o pH 4; F= 1 ml*min-1; V= 20 μl