Naturalne związki organiczne Aleksander Kołodziejczyk Naturalne związki organiczne Gdańsk 2013

Chemii Naturalnych związków Organicznych Program wykładów z Chemii Naturalnych związków Organicznych 30 godz. dla studentów kierunku Biotechnologia Treść   1. Aminokwasy 6. Alkaloidy 2. Peptydy 7. Sterydy i steroidy 3. Białka 8. Hormony, w tym h. płciowe i kortykosterydy 4. Sacharydy 9. Terpeny i terpenoidy 5. Lipidy 10. Związki semiochemiczne, w tym feromony Zaliczenie wykładów: na podstawie sprawdzianu pisemnego lub pisemnego i ustnego ustnego materiału podanego na wykładach.

Literatura uzupełniająca P.D. Bailey, ''An Introduction to Peptide Chemistry'', Wiley, Chichester, 1990. G.C. Barrett, ed., ''Chemistry and Biochemistry of Amino Acids'', Chapman and Hall Ltd, NY, 1985. G.C. Barrett and D.T. Elmore, ''Amino Acids and Peptides'', Cambrodge Universty Press, 1998. A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.Fred Woessner, ''Handbook of Proteolytic Enzymes CD-ROOM, Academic Press, 1998. S.V. Bhat. B.A. Nagasampagi, M. Sivakumar, „Chemistry of Natural Products”, Springer, Narosa, Berlin, Heidelbrg, New York, New Delhi, 2005. M.S. Blum ed., ''Chemistry and Toxicology of Diverse Classes of ALKALOIDS'' , Scientific Publisher Alaken, 1995. M. Bodanszki, ''Peptide Chemistry'', Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, 1988. M. Bodanszky, ''Principles of Peptide Synthesis'', Second Edition, Springer-Verlag, Heidelberg, 1993. C. Branden and J. Tooze, ''Introduction to Protein Structure'', Garland Publishing Inc., New York, 1999. P.M. Collins, R.J. Ferrier, ''Monosacharides, Their Chemistry and Their Roles in Natural Products'', J. Wiley & Sons, Chichester, N. York, Brisbane, Toronto, Singapore, 1995. G. M. Coppola and H.F. Schuster, ""Asymmetric Synthesis: Construction of Chiral Molecules using Amino Acids'', Wiley, New York, 1987. A. Cziczibabin, ''Podstawy Chemii Organicznej'', PWN, Warszawa, 1961. R. Davenport-Hines, „Odurzeni, Historia Narkotyków 1500-2000”, WAB, Warszawa, 2006. J. Davies, ed., ''Amino Acids and Peptides'', Chapman and Hall Ltd, NY, 1985. R. H. Garrett, C. M. Grisham, ''Biochemistry'', Saunders College Publishing, 1999. J.P. Greenstein, M. Winitz, ''Chemistry of the Amino Acids'', J. Wiley, NY-London, 1961. B. Gutte. ''Peptides'', Academic Press, 1995. Z. Gyorgydeak, I. Pelyvas, ''Monosaccharide Sugars'', Academic Press, 1997. H. Jakubke i H. Jeschkeit, ''Aminokwasy, Peptydy, Białka'', PWN, Warszawa, 1989. J.H. Jones, ''The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford, 1991.

P. Illes, C. Farsang, „Regulatory Roles of Opiod Peptides”, VCH, Weinheim, N. York, 1988. P. Kafarski i B. Lejczak, Chemia Bioorganiczna, PWN, Warszawa, 1994. A. M. Kołodziejczyk, „Oils in the environment”, Proc. 4th International Conference, Gdansk 2005, p. 13-24. 1. A.M. Kołodziejczyk, „Przemysłowa produkcja aminokwasów”, Przemysł chemiczny, 84, 84-121 (2005). 1. A.M. Kołodziejczyk, A. S. Kołodziejczyk, „Muramylopeptydy i ich farmakologiczne własności”, Postępy Biochemii, 33, 203-229 (1987). E. Pawełczyk, red. ''Chemia Leków'', PZWL, Warszawa, 1996. G. Patrick, „Chemia Leków”, Krótkie wykłady, PWN, Warszawa, 2004. W. Pigman, D. Horton, ed., ''The Carbohydrates, Chemistry/Biochemistry'', Academic Press, N.Y. and London 1970E. Pijanowski, M. Dłużewski, A. Dłużewska. A. Jarczyk, ''Ogólna technologia żywności'', W N-T, Warszawa, 1996. C. Ratledge, B. Kristiansen, ed., ''Basic Biotechnology'', Cambridge Univesity Press 2001. G. Reineccius, „Flavor Chemistry and Technology”, Taylor&Francis, Boca Raton, London, N. York 2006. M.J. Sadler, J.J. Strain, B. Caballero, ed., ''Encyclopedia of Human Nutrition'', 3-Volume set with Online version, Academic Press, 1998. N. Sewald, H. Jakubke, „Peptides: Chemistry and Biology”, Wiley-VCH, Weinheim, 2002. I. Z. Siemion, ''Biostereochemia'', PWN, Warszawa, 1985. Z.E. Sikorski, red., praca zbiorowa „Chemia żywności. Skład, przemiany i własności żywności'', W N-T, Warszawa, 2000. W. Steglich, B. Fugmann i S. Lang-Fugmann ed., ''Natural Products Rompp Encyklopedia'', Georg Thieme Verlag, Stuttgard, New York, 2000. L. Stryer, ''Biochemia'', PWN, Warszawa, 1997. F. Świderski, red., ''Żywność wygodna i żywność funkcjonalna'', W N-T, Warszawa, 1999. E. Theimer, ''Fragrance Chemistry: The Science of the Sense of Smell'', Academic Press, 1982. A.J. Turner, „Neuropeptides and their Peptidases”, VCH, Ellis Horwood, Wienheim, N. York, Chichester, 1987.

D.E. Vance, J.E. Vance, ''Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and membranes'', Elsevier, 1996. B. Weinstein, ''Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteines'', Marcel Dekker Inc. NY. 1971-1978. R. M. Williams, ''Synthesis of Optically Active a-Amino Acids'', Pergamon Press, Oxford, 1989. A. Wisniewski, J. Madaj, „Podstawy chemii cukrów”, AGRA-ENVIRO lab, Poznań-Gdańsk, 1997. X. Liang, W. Fang, „Medicinal Chemistry of Bioactive Natural Products”, J. Wiley & Sons, New Jersey, 2006. A. Zejca, M. Gorczyca, ed., ''Chemia Leków'', PZWL, Warszawa 1998. S. Zito, ed., ''Pharmaceutic Biotechnology'', Technomic Publishing Co. Inc., Lancaster-Basel, 1997. ''Żywność wygodna i żywność funkcjonalna'', praca zbiorowa pod redakcją F. Świderskiego, W N-T, Warszawa, 1999. A. Kołodziejczyk, „Naturalne Związki Organiczne”, PWN, Warszawa 2012, poprawione wznowienie drugiego wydania. A. Kołodziejczyk, „Naturalne Związki Organiczne”, PWN, Warszawa 2013, wydanie 3, rozszerzone i poprawione, przewidywana data wydania październik 2013

Aleksander Kołodziejczyk 1. A M I N O K W A S Y Gdańsk 2013

A M I N O K W A S Y białkowe (L) niebiałkowe (D lub L) pierwszorzędowe (kodowane) drugorzędowe trzeciorzędowe a-aminokwas

Aminokwasy kodowane alifatyczne Wzór nazwa kod 3-literowy kod 1-literowy pHi glicyna Gly G 5,97 alanina Ala A 6,02 walina Val V 5,97 leucyna Leu L 5,98 izoleucyna Ile I 6,02 prolina Pro P 6,10

seryna Ser S 5,68 treonina Thr T 6,53 hydroksyprolina Hyp - 5,71 Hydroksyaminokwasy seryna Ser S 5,68 treonina Thr T 6,53 hydroksyprolina Hyp - 5,71

Aminokwasy siarkowe cysteina Cys C 5,02 metiona Met M 5,75 cystyna -

5,98 fenyloalanina F Phe tyrozyna Tyr Y 5,65 tryptofan Trp W 5,88 Aminokwasy aromatyczne 5,98 fenyloalanina F Phe tyrozyna Tyr Y 5,65 tryptofan Trp W 5,88

kwas asparaginowy Asp D 2,87 Asn N 5,41 asparagina kwas glutaminowy Aminokwasy kwaśne i ich amidy kwas asparaginowy Asp D 2,87 Asn N 5,41 asparagina kwas glutaminowy Glu E 3,22 glutamina Gln Q 5,65

Lys K 9,74 lizyna Arg R 10,08 arginina H 7,64 histydyna His hydroksy- Aminokwasy zasadowe Lys K 9,74 lizyna Arg R 10,08 arginina H 7,64 histydyna His hydroksy- lizyna Hly -

Aminokwasy białkowe drugorzędowe powstają w wyniku postrybosomalnej modyfikacji głównie w reakcjach: N-alkilowania, C-hydroksylowania i C-halogenowania

Aminokwasy b. trzeciorzędowe powstają w procesach postryboso-malnych, w reakcjach pomiędzy grupami funkcyjnymi różnych AA Utlenienie Cys do (Cys)2

Insulina

Reakcje funkcji bocznych aminokwasów

Aminokwasy niezbędne (egzogenne) dawka [g] aminokwas Arg 1,8 Met 1,1 His 0,9 Phe Ile 0,7 Thr 0,5 Leu Trp 0,25 Lys 0,8 Val Dzienne zapotrze-bowanie dla ludzi Nomenklatura L-alanina, D-walina, DL-leucyna Symbole trójliterowe i jednoliterowe aminokwasów białkowych oznaczają konfigurację L, np. Phe i F oznaczają L-fenyloalaninę, a Tyr i Y – L-tyrozynę Inną konfigurację należy zaznaczyć przed symbolem, np. D-Phe, DL-Tyr, D-P

Niektórzy autorzy konfigura- Zamiast symbolu DL- można stosować przedrostek rac- co oznacza mieszaninę racemiczną, np. rac-Asn Niektórzy autorzy konfigura- cję D przedstawią symbolami pisanymi z małej litery, np. ala, oznacza D-Ala v oznacza D-Val Konfigurację nieznaną oznacza się litery z (czytaj ksi) z-Ser Konfiguracja aminokwasów Wszystkie aminokwasy białkowe (oprócz Gly) są chiralne i mają konfigurację L na Ca. lustro Projekcja Fischera

Chiralne AA białkowe, oprócz Cys mają na Ca konfigurację absolutną S Projekcja Newmana Dwa aminokwasy kodowane: Ile i Thr mają dwa centra chiralne

Właściwości kwasowo-zasadowe W cząsteczce aminokwasu grupy aminowa – NH2 i kwasowa – COOH reagują z sobą tworząc sól wewnetrzną, tzw. jon obojnaczy, inaczej zwitterion Właściwości kwasowo-zasadowe Dysocjacja aminokwasów w roztworze wodnym:

Stałe dysocjacji: Krzywa miareczkowania glicyny

Stałe dysocjacji pKa niektórych aminokwasów kodowanych   Stałe dysocjacji pKa niektórych aminokwasów kodowanych   Stałe dysocjacji pKa niektórych aminokwasów kodowanych Aminokwas pK1 pK2 pK3 pHi Gly   2,3 9,6 - 5,97 Ala 9,7 6,01 Ser 2,2 9,2 5,68 Cys 1,7 8,3 10,8 5,02 Lys 9,1 10,5 9,82 Arg 9,0 12,8 10,76 Asp 1,9 3,7 2,77 Glu 4,3 10,0 3,24    

Stałe dysocjacji dla Asp Stałe dysocjacji dla Lys

Rozpuszczalność Jonowa budowa AA decyduje o ich rozpuszczalności – są polarne i większość AA kodowanych rozpuszcza się w wodzie. Są i trudno rozpuszczalne w wodzie: Najłatwiej w wodzie rozpuszczają się: Hyp – 36 g/100 cm3 i Gly – 25 g/cm3. Wszystkie AA kodowane rozpuszczają się w AcOH i NH3.aq. Jedynie Pro jest rozpuszczalna w EtOH. Temperatura topnienia. Jonowa budowa AA wpływa na ich wysoką temp.top., zwykle przekracza ona 200oC, a czasami nawet 300oC. Niewielka zawartość wody znacznie obniża t.t AA. Zapach . Większość AA kodowanych jest bez zapachu. Cys i Met wydzielają nieprzyjemną woń siarkowodorowo-merkaptanową. Glu ma przyjemny, pobudzający apetyt zapach rosołu (hydrolizatu białkowego). Monoglutaminian sodu stosowany jest jako polepszacz smaku.

Smak. Większość AA białkowych ma słodki (Gly, Ala, Ser, Thr) lub gorzki smak (Tyr, Leu i Ile). Niektóre AA są bez wyraźnego smaku (Lys, Trp, Asp, Asn i Cys). Zmiana konfiguracji z L na D zwykle zmienia smak AA, np. część gorzkich staje się słodkimi, zaś smak AA słodkich zostaje wzmocniony. O smaku wielu produktów, w tym serów, przyprawy sojowej i magii oraz ryb decyduje obecność wolnych AA. Kwas L-glutaminowy (Glu) ma smak obojętny, ale szczególnie jego sól monosodowa – MGN, wpływa na smak wielu potraw. Zdolność do polepszania smaku została określona jako umami; jest to piąty podstawowy smak obok słodkiego, kwaśnego, gorzkiego i słonego. Efekt umami przypomina działanie soli – niektóre potrawy niesłone są niesmaczne, ale bardzo zyskują na smaku po dodaniu niewielkiej ilości soli kuchennej, przy czym nie wyczuwa się smaku słonego. Większa ilość soli psuje smak – potrawy stają się za bardzo słone.

monoglutaminian sodu – MGN MGN dodaje się w ilości 0,2-0,8%. W naturalnych potrawach białko-wych jego stężenie dochodzi do 0,1%. Są potrawy zawierające więcej MGN, np przetwory pomidorowe (0,25%) czy sery (do 0,6%). Spożywanie nadmiernych ilości MNG (ponad 5g dziennie jest szkodliwe). Właściwości toksyczne AA. Nadmiar Leu, przy równoczesnym niedoborze Trp sprzyja pelagrze (rumieniowi lombardzkiemu). Schorzenie to jest rozpowszechnione wśród ludzi, których głównym pożywieniem jest sorgo. Sorgo – zboże, 5 miejsce pod względem światowej produkcji, uprawianie głównie w Afryce i Azji. Pelagra często dokucza niedożywionym więźniom i jeńcom przetrzymywanym w obozach koncentracyjnych.

Karmienie zwierząt doświadczalnych dietą niskobiałką z nadmiarem Tyr daje objawy neurotoksyczne, powoduje ubytek wagi, marskość wątroby i wysoką śmiertelność. Nadmiar Phe daje podobne objawy podobne do fenyloketonurii Nadmiar Trp wywołuje u zwierząt doświadczalnych depresję, nawet przy diecie wysokobiałkowej. Nadmiar Cys i Met powodują nekrozę wątroby i nerek Szkodliwy jest nadmiar AA hydrofobowych. Natomiast wiele AA hydrofilowych (Asp, Arg, Glu, Orn i Lys) jest stosowane jako leki i nawet w dużych dawkach nie wykazują szkodliwego działania.

Naturalne aminokwasy niebiałkowe

Substraty chiralne Zastosowanie aminokwasów do wzbogacania wartości odżywczej pokarmów i pasz jako substancje smakowe do produkcji aspartamu substraty w syntezie chemicznej Substraty chiralne do karmienia pozajelitowego w syntezie peptydów leki

Produkcja najpopularniejszych aminokwsów Lp Aminokwas Wielkość produkcji [t] Główna metoda produkcji Główne zastosowanie 1. Glu 800 000 fermentacja polepszacz smaku 2. Lys 350 000 dodatek paszowy 3. D,L-Met synteza chemiczna 4. Thr 15 000 5. Asp 10 000 kataliza enzymatyczna substrat aspartamu 6. Phe 7. Gly dodatek do potraw, słodzik 8. Cys 3 000 redukcja cystyny dodatek do potraw, w farmacji 9. Arg 1 000 w farmacji 10. Leu 500 11. Ser 400 substrat Trp, w farmacji 12. Val pestycydy, w farmacji 13. Trp 300 inżynieria genetyczna 14. Ile

Przemysłowe otrzymywanie aminokwasów

metionina

Chemiczna synteza aminokwasów Aminowanie halogenokwasów Synteza Gabriela

Synteza z estru aminomalonowego Reakcja Michaela Synteza Streckera

Alkilowanie glicyny, np. kondensacja Perkina Alkilowanie zasady Schiffa – aminoacetonitrylu

Alkilowanie hydantoiny glicyny

Redukcyjne aminowanie a-ketokwasów Syntezy specyficzne

Synteza aminokwasów znaczonych radioizotopami Synteza prebiotyczna

Aminokwasy chiralnie czyste Otrzymywanie: z hydrolizatów białkowych, z innych źródeł naturalnych, poprzez rozdzielanie AA racemicznych, poprzez syntezę chiralną. Oznaczanie czystości chiralnej: polarymetrycznie, za pomocą NMR, chromatograficznie, enzymatycznie lub mikrobiologicznie. Sposoby przedstawiania czystości chiralnej zawartość enancjomeru w mieszaninie racemicznej czystość optyczna – o.p. – (ang. optical purity) nadmiar enenacjomeryczny – e.e. – (ang. enanctiomeric excess) zawartość jednego enancjomeru względem drugiego Jeżeli o.p. = 95%, to e.e. = 90%

PRZYKŁADY SYNTEZ CHIRALNYCH AMINOKWASÓW 1. Syntezy Kagana i Coreya Y = 100%, e.e. = 98% (S)-b-asparaginian metylu 2. Uwodornienie a,b-nienasyconych AA zawierających chiralny podstawnik

3. Redukcja wobec chiralnych katalizatorów Rozpuszczalne katalizatory rodowe, zawierające chiralne ligandy umożliwiają otrzymywanie związków chiralnych z dużą wydajnością chiralną. L: Kat.: Rh2LCl Ac-Phe-OMe; R: a = H; b = CH3 katalizator substrat rozpuszczalnik Y % e.e. (R) Rh2LCl b benzen 87 9 metanol 89 66 a 99 80 [RhL2]+BF- 90 83 91 67 A 82 [RhL’2]+BF- 100 86

Osadzenie katalizatora na stałym nośniku ułatwia jego regenerację wyd. chem 100% RS/SS 99,2/0,8 Do indukowania chiralnego centrum można wykorzystać związki naturalne.

5. Redukcja borowodorem zawierającym chiralne grupy

6. Metody mikrobiologiczne i enzymatyczne Najczęściej wykorzystywanym surowcem w produkcji AK jest glukoza.

Rozdzielanie racemicznych aminokwasów - krystalizacja soli enancjomerycznych - rodzielanie pochodnych diastereoizomerycznych - krystalizacja spontaniczna - metody enzymatyczne - metody chromatograficzne Sole diastereoizomeryczne diastereomeryczne sole diastereomeryczne sole

Diastereoizomeryczne sole rozdziela się najczęściej poprzez krystalizację chiralne zasady: fenyloetyloamina, nitrofenyloetyloamina, naftylofenyloamina, brucyna, efedryna chiralne kwasy: kw. dibenzylowinowy, kw. D-kamforosulfonowy Pochodne diastereoizomeryczne Aminokwasy mogą tworzyć pochodne z chiralnymi: - alkoholami  estry - aminami  amidy - chlorkami kwasowymi  N-acyloaminokwasy - aminokwasami  peptydy Diastereoizomeryczne pochodne AA można rozdzielać za pomocą krystalizacji, chromatografii lub elektroforezy.

Do przekształcania DL-AK w estry można użyć np. mentolu Peptydy też mogą służyć do rozdzielania stereoizomerów. Metody chromatograficzne Stacjonarne fazy chiralne Chiralne fazy ruchome Krystalizacja spontaniczna

Hydroliza enzymatyczna Metody enzymatyczne synteza chiralna anilid AK Hydroliza enzymatyczna Za pomocą proteaz można hydrolizować wiązania estrowe na centrum L.

Utlenienie enzymatyczne i dekarboksylacja Chromatografia cienkowarstwowa i bibułowa

Chromatografia cieczowa Analizator aminokwasowy

Pierwsze próby rozdzielania enancjomerów AA

Rozdzielenie enancjomerów mieszaniny aminokwasów

Chromatogram rozdzielonych enancjomerów wszystkich AA kodowanych 1 – Asp, 2 – asp 3 – Glu, 4 – Asn, 5 – glu, 6 – Ser, 7 – asn, 8 – ser, 9 – Gln, 10 - gln 11 – Thr, 12- Gly, 13 – thr, 14 – His, 15 – his, 16 – Ala, 17 – Arg, 18 – ala, 19 – arg, 20 – Tyr, 21 – tyr, 22 – Val, 23 – Met, 24 – Trp, 25 – met, 26 – val, 27 – Phe, 28 – Ile, 29 – trp, 30 – phe, 31 – Leu, 32 – leu, 32 – ile, 33 – leu, 34 – Lys, 35 - lys

HPLC Śladowe ilości Elektroforeza skręcalność właściwa Z-D-Phe-L-Phe-OMe w Z-L-Phe-L-Phe-OMe Elektroforeza skręcalność właściwa skręcalność molowa

Ala 0,03 Leu 0,02 0,07 1,0 Boc-D-Ala Boc-D-Leu 0,1 Asp Met 0,2 Glu Czystość chiralna aminokwasów komercyjnych Aminokwas lub jego pochodna Zawartość drugiego enancjomeru [%] Ala 0,03 Leu 0,02 D-Ala 0,07 D- Leu 1,0 Boc-D-Ala Boc-D-Leu 0,1 Asp Met D-Asp 0,2 D-Met Glu Boc-D-Met D-Glu 1,1 Sera 1,2 Boc-D-Glu Serb 1,9 His 0,01 Ser(Bzl) D-His 0,04 Ser 0,06

Skręcalność właściwa i molowa niektórych AA (t = 25oC, c = 1-2) aminokwas [a]D w HOH [a]D w HCl [a]D w AcOH [M]D w HOH Ala 1,8 15 33 1,6 Arg 12 28 29 22 Asn -5,6 -7,4 Cys -16 6,5 13 -20 (Cys)2 -212 -232 - -501 w HCl Phe -34 -4,5 -7,5 -57 Ser -7,9 Tyr -11 19,9 Val 5,6 62 6,6

Jon masowy [M + 1]+ Phe i jony fragmentacyjne Jon masowy [M + 1]+ Tyr i jony fragmentacyjne

Strategies for the Synthesis of Labeled Peptides Lisa Bibbs,a Nicholas P. Ambulos,b Steven A. Kates,c Ashok Khatri,d Katalin F. Medzihradszky,e George Ösapay,f and Susan T. Weintraubg FIGURE 3. Tandem mass spectrum obtained by collision-induced dissociation of [M+2H]2+(m/z 587.5) for the test peptide. The fragmentation pattern confirms the expected sequence.