Aktywność katalityczna enzymów Enzymologia-1 Informacje wstępne Aktywność katalityczna enzymów
Praktycznie wszystkie przemiany metaboliczne zachodzą z udziałem W każdej żywej komórce mają miejsce tysiące przemian metabolicznych Praktycznie wszystkie przemiany metaboliczne zachodzą z udziałem BIOKATALIZATORÓW Uproszczony schemat organizacji szlaków metabolicznych
Enzymy Rybozymy Deoksyrybozymy Biokatalizatory: Enzymy zbudowane z aminokwasów (białka) Rybozymy zbudowane z rybonukleotydów (RNA) Deoksyrybozymy zbudowane z deoksyrybonukleotydów
Ważne daty z historii enzymologii Kuhne – wprowadzenie terminu „enzym” 1894 Fisher – teoria „klucza i zamka”, specyficzność substratowa 1897 Buchner – wykazanie, że ekstrakt drożdżowy może katalizować fermentację alkoholową 1913 Michaelis, Menten – podstawy matematycznej analizy kinetyki reakcji enz, 1926 Sumner – pierwsze otrzymanie enzymu w formie krystalicznej (ureaza) 1928 Svedberg – skonstruowanie ultrawirówki 1958 Koshland – teoria „wzbudzonego dopasowania” 1960 Stein, Moore – pierwsze określenie sekwencji aminokwasowej enzymu 1965 Pierwsze określenie struktury przestrzennej enzymu (lizozym) na podstawie danych krystalograficznych. Pierwsza struktura białka (mioglobina) została określona 5 lat wcześniej (Kendrew i in.) 1965 Jacob, Monod – odkrycie zjawiska allosterycznej regulacji aktywności enzymów 1969 Merrifield – chemiczna synteza enzymu (rybonukleaza) 1970 – 1975 pierwsze wyjaśnienia mechanizmów działania enzymów 1970 Wilchek, Cuatrecas – opracowanie techniki chromatografii powinowactwa 1980 – 1985 zastosowanie technik rekombinacji DNA w badaniach enzymologicznych (układy nadekspresyjne, ukierunkowana mutageneza 1986 Cech – odkrycie rybozymu
Enzymy są „superkatalizatorami” niezwykle duża efektywność katalizy wysoka aktywność katalityczna w umiarkowanych warunkach swoistość reakcji specyficzność substratowa stereospecyficzność praktycznie 100% wydajność; brak produktów ubocznych
SWOISTOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNYCH L-asparaginaza EC 3.5.1.1
SWOISTOŚĆ SUBSTRATOWA L-asparaginaza EC 3.3.1.1
Stereospecyficzność działania enzymów -H2O +H2O
Stereospecyficzność działania enzymów
Niektóre zlokalizowane są w błonach biologicznych Niektóre są białkami rozpuszczalnymi - globularnymi
Niektóre enzymy pomagają przemieszczać się substratom, półproduktom i produktom Enzymy oligomeryczne Enzym z kanałem wewnętrznym
Topoizomeraza – enzym skręcający i rozkręcający DNA
Polimeraza DNA – enzym łączący nukleotydy na podstawie sekwencji matrycy
Podobieństwo struktur przestrzennych enzymów Struktury racemazy kwasu mandelowego I enzymu laktonizujacego kwas mukonowy Struktury dwóch proteaz serynowych: chymotrypsyny i subtilizyny
Dlaczego enzymy są tak efektywnymi katalizatorami? grupy funkcyjne w centrum aktywnym hydrofobowy charakter centrum aktywnego współdziałanie koenzymów kataliza kwasowo-zasadowa maksymalne zbliżenie i optymalne ustawienie substratu(ów) wzbudzone dopasowanie enzymu
W centrum aktywnym enzymu znajdują się reszty wiążące substrat(y) i koenzym Wiązanie koenzymu i substratu przez aminotransferazę kwasu asparaginowego Wiązanie substratu przez racemazę kwasu mandelanowego
Koenzym Grupa prostetyczna Niektóre enzymy potrzebują pomocników... Koenzym - niewielka cząsteczka organiczna współpracująca z cząsteczką enzymu podczas aktu katalitycznego, której obecność jest niezbędna dla katalizy. Koenzym wiąże się z enzymem tylko w trakcie aktu katalitycznego Grupa prostetyczna - cząsteczka organiczna lub jon metalu niezbędna dla działania enzymu, połączona trwale z cząsteczką enzymu
Niektóre enzymy potrzebują pomocników... Jony metali jako grupy prostetyczne enzymów
Szybkość reakcji enzymatycznej Enzym, podobnie jak każdy inny katalizator, przyśpiesza reakcję, ale nie zmienia jej stanu równowagi. Enzymy katalizują jedynie reakcje termodynamicznie możliwe, czyli takie, dla których G0. Uwaga: enzymy w komórkach mogą katalizować reakcje, dla których G>0. Warunek: sprzężenie z reakcją, dla której G<0. Warunkiem zajścia reakcji jest efektywne zderzenie cząsteczek (cząsteczki muszą posiadać odpowiednią energię oraz być odpowiednio ustawione względem siebie) Najmniejsza energia, którą należy dostarczyć molowi substratów, aby każda z cząsteczek stała się reaktywna – energia aktywacji Szybkość reakcji zależy od energii aktywacji układu. v = f (G*)
Enzymy obniżają energię aktywacji układu Energia aktywacji (kJ/mol) Połowiczny czas reakcji I rzędu w 27C 62.7 83.6 104.5 125.4 0.007 s 14 s 19 h 38 h Energia aktywacji a szybkość reakcji Energię aktywacji można wyznaczyć k = A exp(-G*/RT) ln k = f(1/T) G*
Enzymy obniżają energię aktywacji układu
Oddziaływanie enzym: substrat Teoria wzbudzonego dopasowania Teoria klucza i zamka
Enzym wiążąc substrat przyjmuje konformację komplementarną do stanu przejściowego
Enzym przyciąga substrat do centrum aktywnego Sposoby oddziaływań elektrostatycznych enzymu z substratem Rozkład potencjału elektrostatycznego wokół enzymu – dysmutazy nadtlenkowej Pokazano obszary potencjału dodatniego i ujemnego. Substrat: O2-. jest naładowany ujemnie
Wykres zależności szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od stężenia substratu ma kształt hiperboliczny
Wykres zależności szybkości reakcji katalizowanej przez enzym allosteryczny od stężenia substratu ma kształt sigmoidalny
Czynniki wpływające na aktywność enzymu temperatura odczyn środowiska potencjał redoks Zależność aktywności enzymu od temperatury Zależność aktywności enzymu od pH
Aktywność enzymów może być hamowana
Aktywność enzymu może być regulowana Regulacja allosteryczna Stosunkowo niewielkie cząsteczki – ligandy allosteryczne - wiążą się z enzymami oligomerycznymi, zwiększając lub zmniejszając ich aktywność. Regulacja ma charakter płynny. Dotyczy często enzymu katalizującego pierwszą reakcję w szlaku biosyntetycznym. Regulacja kowalencyjna Enzym traci lub zyskuje aktywność w wyniku odłączenia lub przyłączenia małej grupy funkcyjnej, katalizowanego przez inny enzym. Regulacja ma najczęściej charakter zero-jedynkowy.
[Aktywność molekularna] = U/mol = min-1 Aktywność enzymu – ilość enzymu katalizująca przekształcenie 1 mola substratu w produkt w jednostce czasu. Jeżeli jednostką czasu jest 1 min, to aktywność jest wyrażona w jednostkach U [U] = mol/min; w układzie SI katal = mol/s 1 katal = 6 107 U Aktywność molekularna – liczba cząsteczek substratu przekształcona w produkt w czasie 1 min przez 1 cząsteczkę enzymu w optymalnych warunkach Nazwa stosowana poprzednio – liczba obrotów [Aktywność molekularna] = U/mol = min-1
Aktywność molekularna 60 = kkat Stała katalityczna Stała katalityczna określa liczbę mikromoli substratu przekształconych przez 1 mol enzymu w produkt w ciągu 1 sekundy w optymalnych warunkach kkat = V/[E] [kkat] = s-1 Aktywność molekularna 60 = kkat Dla enzymów zawierających więcej niż jedno centrum katalityczne Aktywność centrum katalit. = aktywność molekularna/liczba centrów
Izoenzymy Różne formy tego samego enzymu występujące w różnych organellach komórki lub różnych tkankach tego samego organizmu. Izoenzymy mogą się różnić m.in. strukturą przestrzenną, stopniem ufosforylowania, sposobem regulacji aktywności. Różnice te są konsekwencją niewielkich zmian struktury I-rzędowej.
Rybozymy i Deoksyrybozymy Cząsteczki RNA lub DNA wykazujące aktywność autokatalityczną lub katalityczną RNaza P Autokatalityczne introny Rybozymy typu „głowa młotka” i enzymy DNA Transferaza peptydylowa w rybosomie Mechanizm katalityczny rybozymów: Rybozym rozpoznaje sekwencję komplementarną docelowego mRNA poprzez hybrydyzację typu Watsona – Cricka. Po przyjęciu aktywnej konformacji w kompleksie dochodzi do degradacji wiązania fosfodiestrowego w nici mRNA. Tworzy się kompleks rybozymu z produktami degradacji. Kompleks ten ulega rozdysocjowaniu, dając produkty reakcji, oraz uwolniony rybozym zdolny do następnego cyklu katalizy.
Autokatalityczne introny Struktura autokatalitycznego intronu z prekursora rRNA Tetrahymena, wycinającego się bez pomocy białek Mechanizm autokatalitycznego splicingu
Niektóre rybozymy i enzymy DNA przecinają mRNA Modele struktur II-rzędowych rybozymu typu „głowa młotka” (ang. hammerhead) i enzymu DNA Konformacja zwiniętego kompleksu rybozymu typu „głowa młotka” z mRNA
Transferaza peptydylowa – największy rybozym
Rybosom
Obraz miejsca tworzenia wiązania peptydowego w rybosomie