Kinetyka reakcji enzymatycznych Enzymologia-9 Kinetyka reakcji enzymatycznych

Określanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej

Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkach stanu stacjonarnego

Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkach stanu przedstacjonarnego

Kinetyka reakcji enzymatycznej Model Michelisa-Menten

KINETYKA REAKCJI MONOSUBSTRATOWYCH Równanie opisujące kinetykę reakcji można ułożyć przyjmując jedno z założeń:   a. Założenie równowagi k2 << k-1 wprowadzając , oraz: v = k2 [E:S], jak również wiedząc, że na całkowite stężenie enzymu składa się stężenie enzymu wolnego oraz enzymu tworzącego kompleks z substratem, czyli: [Ec] = [E] + [E:S], otrzymuje się ostatecznie: , lub , gdzie kkat = k2 to stała katalityczna Ponieważ enzym działa z maksymalną szybkością V, jeżeli wszystkie jego cząsteczki tworzą kompleks z substratem, czyli gdy [E:S] = [Ec], to: V = kkat[Ec] Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu r-gi nosi nazwę stałej substratowej i jest często określana symbolem Ks.

b. Założenie stanu ustalonego = 0; = k1 [E][S] – (k-1[E:S] + k2[E:S]) wprowadzając stałą i przekształcając równanie otrzymuje się: v =   Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu ustalonego nosi nazwę stałej Michaelisa - KM. Warto zauważyć, że KM = Ks + , czyli KM = Ks, jeżeli k2<<k1

GRAFICZNE METODY WYZNACZANIA STAŁYCH KINETYCZNYCH Równanie Lineweavera-Burka

2. Równanie Eadiego-Hofstee 3. Równanie Hanesa

Bezpośredni wykres liniowy

Znaczenie parametrów kinetycznych KM – stanowi miarę stężenia substratu wymaganego do osiągnięcia znaczącej szybkości reakcji; przy tym stężeniu połowa miejsc aktywnych jest obsadzona. Większość enzymów działa w warunkach, w których [S] jest bliskie KM lub nieco od niego mniejsze. Jeżeli KM jest bliskie Ks, to można uznać tą wartość za miarę powinowactwa enzymu do danego substratu. V - szybkość działania enzymu w warunkach pełnego wysycenia substratem, czyli gdy [S] >> KM. Stanowi miarę efektywności katalitycznej. W warunkach fizjologicznych [S]/KM mieści się zwykle między 0,01 a 1,0. W tych warunkach tylko niewielka liczba miejsc aktywnych jest zajęta, a enzym działa z szybkością dużo mniejszą od V (czyli kkat). Prawdziwa jest przybliżona zależność: (przy czym [E]  [E]c) a stosunek kkat/KM jest miarą wydajności katalitycznej enzymu.

Znaczenie parametru (i) Określanie specyficzności enzymu wobec danego substratu podstawiając [Ec] = [E] + [E:S] i pamiętając, że , otrzymujemy i ostatecznie gdzie - pozorna drugorzędowa stała szybkości jeżeli [S1] = [S2], to

Enzymy, dla których znajduje się pomiędzy 108-109 M-1s-1 (ii) założenie stanu ustalonego, czy założenie równowagi? Z założenia stanu ustalonego: Jeżeli k2>>k-1, co jest ekstremalną formą założeń stanu ustalonego, to: , czyli: Jeżeli szybkość wiązania substratu jest kontrolowana dyfuzyjnie, to k1  109 M s-1 Jeżeli wartość jest tego rzędu, to założenie stanu ustalonego ma sens, natomiast, jeżeli << 109, to właściwsze jest założenie równowagi. Enzymy, dla których znajduje się pomiędzy 108-109 M-1s-1 osiągnęły perfekcję kinetyczną, tzn. ich szybkość katalityczna jest ograniczona wyłącznie szybkością dyfuzji substratów

KINETYKA REAKCJI DWUSUBSTRATOWYCH Mechanizm tworzenia kompleksu   E + A + B  [E:A:B]  [E:P:Q]  E + P +Q Kompleks może się tworzyć w sposób: -         uporządkowany (ordered binding) E + A  [E:A] [E:A] + B  [E:A:B] E + B nie tworzą [E:B] -         przypadkowy (random binding) E + A  [E:A] [E:A] + B  [E:A:B] E + B  [E:B] [E:B] + A  [E:A:B] b. mechanizm ping-pong   E + A  E + P E + B  E + Q

- - dla mechanizmu ping-pong MODEL OGÓLNY WIĄZANIA KA i KB – stałe Michaelisa dla każdego z substratów przy wysycających stężeniach drugiedrugiego substratu V – szybkość maksymalna przy wysycających stężeniach obu substratów RÓWNANIA KINETYCZNE   - dla mechanizmu tworzenia kompleksu -         - dla mechanizmu ping-pong

OKREŚLANIE TYPU MECHANIZMU REAKCJI DWUSUBSTRATOWEJ NA PODSTAWIE DANYCH KINETYCZNYCH Dokonuje się pomiarów szybkości reakcji dla różnych wartości [A0] utrzymując stałe [B]. Powtarza się to dla kilku wartości [B]. Sporządza się wykresy w układzie Lineweavera-Burke’a.   Jeżeli otrzymuje się układ prostych przecinających się, to reakcja przebiega z utworzeniem kompleksu Dla każdej linii określa się nachylenie i punkt przecięcia z osią 1/v Tworzy się wykresy wtórne

b. Jeżeli otrzymuje się układ prostych równoległych, to reakcja przebiega mechanizmem ping-pong Jedyny wykres wtórny:

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Stosując założenie stanu równowagi można wyprowadzić następujące równania ogólne: KES = KM; KEI = KI

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Założenie ograniczające: KESI = ; ES nie może łączyć się z I, a EI z S V= V; KM > KM Inhibicja kompetytywna

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Założenie ograniczające: KESI = KEI; wiązanie S nie wpływa na wiązanie I V< V; KM = KM Inhibicja niekompetytywna

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Założenie ograniczające: KEI = ; I łączy się tylko z ES V< V; KM < KM Inhibicja pozakompetytywna