Projektowanie metabolizmu Otrzymywanie szczepów przemysłowych

Otrzymywanie wysokowydajnych producentów metabolitów wtórnych o działaniu farmakologicznym

Cechy szczepu wysokowydajnego maksymalna wydajność pożądanego produktu minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych stabilność genetyczna odporność na zakażenia wirusowe

Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów optymalizacja warunków wzrostu

Otrzymywanie wysokowydajnych producentów metabolitów pierwotnych Założenia: dobra znajomość szlaków metabolicznych i mechanizmów kontroli metabolizmu -konieczność wyeliminowania mechanizmów kontroli ograniczających poziom wytwarzania danego metabolitu -pożądane wyeliminowanie aktywności konkurencyjnych szlaków biosyntezy (w przypadku gdy dany metabolit nie jest końcowym produktem szlaku – konieczność zablokowania jego dalszych przemian) -pożądane wprowadzenie zmian struktury enzymu(ów) katalizujących przemiany kluczowe dla biosyntezy danego metabolitu, prowadzących do zwiększenia aktywności tego(tych) białek -niekiedy przydatne wprowadzenie zmian w transporcie komórkowym (pożądane efekty: zwiększenie szybkości dopływu substratów lub usuwania produktu)

Mutanty szczególnie przydatne dla otrzymywania wysokowydajnych producentów metabolitów pierwotnych MUTANTY AUKSOTROFICZNE (ŻYWIENIOWE) Komórki pozbawione aktywności co najmniej jednego enzymu katalizującego reakcję szlaku biosyntetycznego MUTANTY REGULATOROWE mutacja w genie regulatorowym lub w obszarze promotorowym powodująca stałą derepresję biosyntezy; mutacja w genie strukturalnym, w efekcie której produkt genu ma niezmienioną aktywność katalityczną, ale traci wrażliwość na działanie inhibitora allosterycznego

Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger

Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger

ULEPSZANIE SZCZEPÓW PRZEMYSŁOWYCH ·        Mutagenizacja ·        Hybrydyzacja szczepów ·        Technologia rekombinowanego DNA

Mutagenizacja szczepów 1 – mutacje pierwotne 2 – mechanizm naprawczy; odtworzenie stanu pierwotnego 3 – mechanizm naprawczy; mutacje wtórne 4 – śmierć komórki 5 – śmierć komórki 6 – namnażanie zmutowanych komórek Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy

Selekcja mutantów auksotroficznych Metoda penicylinowa otrzymywania mutantów auksotroficznych bakterii

Selekcja mutantów auksotroficznych Metoda replik z testem auksanograficznym 1,3 – płytki z podłożem kompleksowym; 2 – płytka z podłożem minimalnym

Selekcja mutantów regulatorowych Metoda płytek gradientowych (Szybalskiego)

Hybrydyzacja

Hybrydyzacja Podstawa metody: cykl paraseksualny grzybów  plasmogamia  komórki heterokariotyczne  kariogamia komórki diploidalne  możliwość wystąpienia mitotycznej rekombinacji genetycznej i w efekcie diploidalnych rekombinantów  segregacja materiału genetycznego i haploidyzacja  haploidalne rekombinanty

Hybrydyzacja – fuzja protoplastów Główna przeszkoda w naturalnej plazmogamii – ściana komórkowa Protoplastyzacja komórek zasadniczo zwiększa częstotliwość Dodatkowe zalety protoplastyzacji: możliwość fuzji i rekombinacji pomiędzy szczepami o tym samym typie płciowym -możliwość rekombinacji międzygatunkowej -możliwość jednoczesnej rekombinacji kilku genotypów w jednym doświadczeniu -możliwość wymiany dużych fragmentów DNA -ułatwienie transformacji -możliwość fuzji protoplastów z liposomami zawierającymi DNA -możliwość fuzji protoplastów komórkowych z organellami, np. mitochondriami   Techniki fuzji -środowisko 30% PEG o masie 1 000 – 6 000 D, jony Ca(II), pH 9,0 -elektrofuzja – impulsy do 10 kV/cm (kilka ms) Po fuzji regeneracja ściany w środowisku stabilizowanym osmotycznie, selekcja

Hybrydyzacja – fuzja protoplastów Metody otrzymywania protoplastów Zasada: enzymatyczna hydroliza ściany komórkowej w warunkach zapewniających osmotyczną stabilizację powstających protoplastów Stabilizacja osmotyczna: sole nieorganiczne, np. MgSO4, cukry, np. sacharoza, zredukowane cukry, np. sorbitol, w stężeniach 0,5 – 1,5 M. Komórki bakteryjne: gramdodatnie – lizozym; gramujemne – lizozym + EDTA + SDS Komórki grzybowe: -glukuronidaza z Helix pomatia; chitynaza + -glukanaza (np. Zymolase)

Hybrydyzacja – fuzja protoplastów Przykłady zastosowania:   ·        Praktycznie wszystkie szczepy przemysłowe używane do produkcji antybiotyków w wiodących firmach farmaceutycznych są rekombinantami otrzymanymi w wyniku fuzji protoplastów; ·        Szczepy zawierające wiele kopii genów odpowiedzialnych za biosyntezę antybiotyku (np. Penicillium chrysogenum zaw. 20 zestawów genów kodujących wytwarzanie penicyliny G); ·        Fuzja protoplastów dwóch szczepów Cephalosporium acremonium wytwarzających cefalosporynę C: wysokowydajnego, ale wolno rosnącego i nie wytwarzającego spor oraz drugiego o cechach odwrotnych. Rekombinant posiadał kombinacje cech korzystnych; wydajność o 40% lepsza niż wydajniejszy ze szczepów rodzicielskich.

Cel współczesnej i przyszłej biotechnologii otrzymywania metabolitów wtórnych: Wytwarzanie złożonych substancji naturalnych, ich biokombinatorycznych (hybrydowych) pochodnych oraz zupełnie nowych substancji z wykorzystaniem całkowicie zaplanowanych procesów biosyntezy Modyfikacja enzymów przy pomocy inżynierii białek dająca w efekcie nowe spektra substratowe oraz nowe mechanizmy katalizy

STRATEGIE ZMIAN METABOLIZMU DROBNOUSTROJÓW MAJĄCE NA CELU ZWIĘKSZENIE WYDAJNOŚCI BIOSYNTEZY METABOLITÓW WTÓRNYCH Amplifikacja genów biosyntezy całego szlaku lub jego części Zwiększenie odporności na antybiotyki w wyniku zmian w genach warunkujących odporność Zwiększenie wydzielania produktu poprzez zmiany w genach kodujących błonowe białka transportowe oraz białka regulujące systemy transportu Zmiany w genach kodujących białka regulatorowe (regulatory ogólne lub specyficzne dla szlaku) Celowe usunięcie etapów limitujących szybkość metabolizmu Wyłączenie genów, kodujących enzymy odpowiedzialne za biosyntezę niepożądanych produktów ubocznych Przeniesienie całego procesu biosyntezy do innego heterologicznego organizmu produkcyjnego

Zastosowanie technologii rekombinowanego DNA do otrzymywania wysokowydajnych szczepów wytwarzających antybiotyki