Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka szczepionek Ściśle zdefiniowany skład Bezpieczeństwo produkcji wyeliminowanie konieczności hodowli mikroorganizmów chorobotwórczych w celu izolacji antygenów szczepionkowych mikroorganizmy stosowane do produkcji antygenów rekombinantowych o statusie GRAS (Generally Recognized as Safe) Bezpieczeństwo stosowania brak możliwości wywołania choroby niska odczynowość Wymagają stosowania adiuwantów Koszt produkcji uzależniony od stosowanego systemu produkcji

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Bakterie dobrze scharakteryzowane łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych wydajne systemy ekspresyjne brak modyfikacji posttranslacyjnych możliwość produkcji białek w postaci nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające rozpuszczalność, zwiększające immunogenność

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Drożdże dobrze scharakteryzowane łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych wydajne systemy ekspresyjne trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z genomem gospodarza modyfikacje posttranslacyjne – tworzenie mostków disiarczkowych, glikozylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające immunogenność

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Komórki owadzie systemy ekspresyjne oparte na plazmidach lub bakulowirusie modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja inna niż w komórkach ssaczych wrażliwe na zakażenia wirusowe Komórki ssacze modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja, fosforylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych, tworzenie mostków disiarczkowych droga hodowla stabilne produkcyjne linie komórkowe trudne do otrzymania

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Rośliny transgeniczne manipulacje genetyczne trudne do przeprowadzenia tania produkcja modyfikacje posttranslacyjne szczepienie drogą pokarmową wywołanie odporności błon śluzowych

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Czynnik etiologiczny – wirus HBV Rodzina: Hepadnaviridae Rodzaj: Orthohepadnavirus Struktura: ikosaedralny nukleokapsyd otoczony podwójną osłonką; kulisty; śr. 42 nm Kwas nukleinowy: DNA Replikacja: hepatocyty Rezerwuar: człowiek

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Droga przenoszenia: krew i płyny ustrojowe, w tym wydzielina szyjki macicy, nasienie Wysoka zakaźność – nawet 0,1 μl krwi może spowodować zakażenie Hodowla w warunkach laboratoryjnych – nie zakaża zarodków kurzych i powszechnie stosowanych linii komórkowych We krwi do 1010 wirusów/ml

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Ostre wirusowe zapalenie wątroby typu B Okres wylęgania 2 – 3 miesiące Początkowe objawy: złe samopoczucie, utrata apetytu, gorączka Żółtaczka Wyzdrowienie (90%) Przewlekłe zakażenie (10%) Nadostre zapalenie wątroby (0,1%) Przetrwałe zapalenie wątroby niewielkie uszkodzenie wątroby Aktywne zapalenie wątroby Antygenemia brak uszkodzenia wątroby Marskość wątroby Pierwotny rak wątroby Zgon

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Wirusowe zapalenie wątroby typu B zakażenie okołoporodowe Dzieci urodzone przez matki w ostrej fazie wzw B zakażenie z ostrymi objawami choroby Dzieci urodzone przez matki z przewlekłym aktywnym wzw B zakażenie bez ostrych objawów choroby nosicielstwo HBV śmierć z powodu marskości wątroby lub raka wątroby (50% chłopców, 15% dziewczynek) Na świecie 200 mln nosicieli HBV z tego 75% ulega zakażeniu podczas porodu

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Antygeny wirusa HBV HBcAg – białko rdzenia HBeAg – białko rdzenia HBsAg – białko powierzchniowe tworzy zewnętrzną osłonkę wirusa nadmiar białka obecny we krwi w postaci kulistych lub pałeczkowatych agregatów

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Gen kodujący antygen HBsAg – koduje 3 polipeptydy preS1 preS2 S

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Odpowiedź immunologiczna na zakażenie HBV Odpowiedź humoralna przeciwciała anty-HBsAg (preS1, preS2 i S) przeciwciała anty-HBcAg przeciwciała anty-HBeAg Odpowiedź komórkowa limfocyty Tc

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki I generacji (plazmatyczne) Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBsAg białko S śladowe ilości białka preS1 śladowe ilości białka preS2 Sposób otrzymywania – izolacja ciał kulistych i pałeczkowatych z krwi bezobjawowych nosicieli HBV, inaktywacja formaldehydem Bezpieczeństwo – ryzyko transmisji patogenów przenoszonych przez krew Nie są stosowane w Polsce

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Pierwsza szczepionka zarejestrowana w 1986 r. Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBsAg białko S Sposób otrzymywania – produkcja białka S w komórkach drożdży S. cerevisiae

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Pierwszy układ ekspresyjny opublikowany w 1982 r. (P. Valenzuela, A. Medina, W.J. Rutter, Nature, 289, 347 – 350) wektor ekspresyjny – pHBS-16 autonomiczna replikacja ori replikacji pBR322 gen oporności na ampicylinę ori replikacji plamidu 2μ gen trp1 sekwencja kodująca białko S pod kontrolą promotora ADH I dehydrogenazy alkoholowej I

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) gospodarz – S. cerevisiae XV610-8C szczep auksotroficzny – brak zdolności do wzrostu na podłożu nie zawierającym tryptofanu białko S produkowane w postaci kulistych agregatów (agregaty 1000x bardziej immunogenne niż pojedyncze cząsteczki białka S) 2 – 5 μg białka z 200 ml hodowli

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Adiuwant – wodorotlenek glinu Postać szczepionki – płynna Temperatura przechowywania – 2-8°C Sposób podawania – domięśniowo Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6 tyg.; 3 – po 6 m-cach od pierwszego szczepienia) Skuteczność szczepionki u 95% szczepionych ochronny poziom przeciwciał po 3 dawkach u 95 – 100% szczepionych skuteczna ochrona przed zachorowaniem 95% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed zakażeniem 98% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed zakażeniem po podaniu szczepionki i HBIg w dniu urodzenia indukuje powstanie trwałej pamięci immunologicznej

Narastanie stężenia i powinowactwa przeciwciał w cyklu szczepień przeciwko WZW typu B

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Bezpieczeństwo szczepionki – wysokie może być stosowana u kobiet ciężarnych matek karmiących piersią osób z niedoborami odporności Niepożądane odczyny poszczepienne łagodne miejscowe odczyny poszczepienne rzadko występujące odczyny ogólne – powiększenie węzłów chłonnych, wymioty, biegunka, nudności, obniżenie ciśnienia krwi, zaburzenia ze strony układu nerwowego Przeciwwskazania do szczepień nadwrażliwość na składniki szczepionki ciężkie choroby przebiegające z wysoką gorączką

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Skuteczne w szczepieniu poekspozycyjnym – uodpornienie czynno-bierne (4 dawki – 0, 1, 2, 12 m-cy; HBIg równocześnie z pierwszą dawką szczepionki) Dostępne w postaci szczepionek monowalentnych Engerix B, GlaxoSmithKline H-B-VAX, Merck Sharp Dohme Dostępne w postaci szczepionek skojarzonych Hexavac, Aventis Pasteur (błonica, tężec, krztusiec, polio, Hib, WZW B) Ambirix, GlaxoSmithKline (WZW A, WZW B) Procomvax, Merck Sharp Dohme (WZW B, Hib)

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Hansenula polymorpha (Hepavax Gene, Green Cross Vaccine, Korea) Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Pichia pastoris

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki III generacji (rekombinowane) Białka S i preS2 produkowane w linii komórkowej CHO (Chinese Hamster Ovary cells), Heprecombe, Swiss Serum and Vaccine Institute

Saccharomyces cerevisiae Niski poziom produkcji i sekrecji białek Niestabilność plazmidów rekombinantowych Hiperglikozylacja białek Wąski zakres metabolizowanych źródeł węgla

Optymalna temperatura wzrostu Pichia pastoris i Hansenula polymorpha - podstawowa charakterystyka biochemiczna P. pastoris H. polymorpha Źródła węgla i energii glukoza glicerol metanol Źródła azotu jony amonowe sole kwasu azotowego (V) Optymalna temperatura wzrostu 30 °C 37-43 °C

Metabolizm metanolu 1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – syntaza dihydroksyacetonu, 4 - dehydrogenaza formaldehydowa, 5 – dehydrogenaza mrówczanowa, 6 - kinaza dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu, 8 – fosfataza fruktozo- 1,6-bisfosforanu

Drożdżowe systemy ekspresyjne Szczepy gospodarzy ekspresyjnych Wektory ekspresyjne bakteryjne ori replikacji bakteryjny marker selekcyjny sekwencja umożliwiająca utrzymanie się wektora w komórce drożdży drożdżowy marker selekcyjny drożdżowy promotor i terminator transkrypcji AmpR PTEF1 Drożdżowy wektor ekspresyjny PHO5t ColE1 ori 25S rDNA URA3

Szczepy ekspresyjne Pichia pastoris Fenotyp Uwagi X-33, Y-11430 szczep dziki Selekcja antybiotykowa GS115 His-, Mut+ Selekcja na podłożu bez histydyny; szybki metabolizm metanolu KM71 His-, Muts Selekcja na podłożu bez histydyny; wolny metabolizm metanolu SMD1168 His-, Pep4-, Mut+ Selekcja na podłożu bez histydyny; brak aktywności proteazy A; szybki metabolizm metanolu JC300 Ade-, Arg-, His- Selekcja na podłożu bez adeniny, argininy i histydyny JC308 Ade-, Arg-, His-, Ura- Selekcja na podłożu bez adeniny, uracylu, histydyny i argininy

Szczepy ekspresyjne Hansenula polymorpha Fenotyp Uwagi DL-1, NCYC495, CBS4732 szczep dziki Selekcja antybiotykowa DL10 Leu-, Ura- Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu uDLB11 Leu-, Ura-, Pep4- Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu; brak aktywności proteazy A L1 Leu- Selekcja na podłożu bez leucyny A11 Ade- Selekcja na podłożu bez adeniny LR9 Ura- Selekcja na podłożu bez uracylu

Promotory transkrypcji P. pastoris Uwagi AOX1 (genu oksydazy alkoholowej) Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy i glicerolu FLD1 (genu dehydrogenazy formaldehydowej) Indukowany metanolem i metyloaminą; represja w obecności glukozy i glicerolu PEX8 (genu kodującego białko tworzące matrix peroksysomów) Słaba aktywność w obecności glukozy; wzrost aktywności w obecności metanolu GAP (genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego) Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i glicerolu YPT1 (genu GTPazy niezbędnej w sekrecji białek) Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i metanolu

Promotory transkrypcji H. polymorpha Uwagi MOX (genu oksydazy metanolowej) Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy; aktywny w obecności glicerolu DHAS (genu syntazy dihydroksyacetonu) FMD (genu dehydrogenazy mrówczanowej) AMO (genu oksydazy aminowej) Indukowany metylo- i etyloaminą; represja w obecności jonów amonowych YNT1, YNI1, YNR1 (genów kodujących białka niezbędne w metabolizmie azotanów) Indukowane solami kwasu azotowego (V), represja w obecności jonów amonowych GAP (genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego) Konstytutywny PMA1 (genu ATPazy błony cytoplazmatycznej)

Drożdżowe markery selekcyjne P. pastoris geny oporności na antybiotyki gen oporności na zeocynę markery auksotroficzne gen HIS4 P. pastoris lub S. cerevisiae gen ARG4 S. cerevisiae gen URA3 P. pastoris gen ADE1 P. pastoris

Drożdżowe markery selekcyjne H. polymorpha geny oporności na antybiotyki gen oporności na zeocynę gen oporności na fleomycynę markery auksotroficzne gen LEU 1.1 H. polymorpha gen URA3 H. polymorpha gen ADE11 H. polymorpha gen LEU2 S. cerevisiae gen URA3 S. cerevisiae gen LEU2 C. albicans

Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży P. pastoris Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną z genomem drożdży 5’ fragment promotora AOX1 5’ fragment promotora GAP gen HIS4 P. pastoris

Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży H. polymorpha Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora z genomem drożdży gen MOX H. polymorpha gen AMO H. polymorpha gen LEU2 S. cerevisiae gen URA3 S. cerevisiae Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdży sekwencje ARS H. polymorpha

Zewnątrzkomórkowa produkcja białek Sekwencje sygnalne obcego białka α-faktora S. cerevisiae kwaśnej fosfatazy

Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez komórki drożdży Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych genów kodujących białka opiekuńcze obecne w retikulum endoplazmatycznym Foldazy izomerazy disulfidowe Białka opiekuńcze kalneksyna kalretikulina

Kierowanie białek do peroksysomów Peroksysomy Zdolne do akumulacji dużej ilości białek Nie zawierają enzymów modyfikujących białka fosfokinaz glikozylaz proteaz Umożliwiają produkcję niezmodyfikowanych białek Sekwencja kierująca do peroksysomów -Ser-Lys-Leu-COOH peroksysomy H. polymorpha rosnąca w pożywce z metanolem

Szczepionki przeciwko wirusowi HPV (wirusowi ludzkiego brodawczaka) Silgard (MSD) Substancja czynna – białko L1 czterech typów HPV (16, 18, 6 i 11) Adiuwant – sole glinu Cervarix (GlaxoSmithCline) Substancja czynna – białko L1 dwóch typów HPV (16 i 18) Adiuwant – sole glinu + MPL (monofosforylowany lipid A) Białko L1 produkowane w drożdżach S. cerevisiae