Anna Wiecheć Zakład Spektroskopii Stosowanej Obrazowanie i analiza blastocyst bydlęcych - zastosowanie spektroskopii wibracyjnej (FTIR) Anna Wiecheć Zakład Spektroskopii Stosowanej Seminarium IFJ 15.03.2012

PLAN SEMINARIUM: Spektroskopia FTIR Co to są blastocysty Materiał badawczy – utrwalone blastocysty bydlęce Metoda badawcza – spektroskopia w podczerwieni z zastosowaniem źródła laboratoryjnego i detektora FPA Rezultaty – mapy 2D, analiza statystyczna (hierarchiczna analiza klastrowa z zastosowaniem metody Warda, analiza głównych składowych PCA, analiza wybranych pików) Podsumowanie

Spektroskopia wibracyjna w podczerwieni z zastosowaniem transformaty Fouriera (spektroskopia FTIR) Metoda polega na analizie pochłoniętego promieniowania elektromagnetycznego przez badaną substancję (drgające cząsteczki). Prawo Lamberta-Beera: Natężenie światła padającego na próbkę maleje wykładniczo, ze wzrostem długości drogi tego promieniowania w próbce I=I0 10-cαd A cαd = I log http://pl.wikipedia.org/wiki/Prawo_Lamberta-Beera d I – natężenie promieniowania po przejściu przez próbkę I0 - natężenie promieniowania padającego na próbkę d – długość drogi promieniowania w próbce c - stężenie molowe substancji absorbującej α - molowy współczynnik absorpcji Absorbancja A zależy od rodzaju promieniowania, stężenia substancji w próbce i długości drogi promieniowania w próbce.

Źródło promieniowania IR (polichromatyczne) Spektroskopia wibracyjna w podczerwieni z zastosowaniem transformaty Fouriera (spektroskopia FTIR) Idea pomiaru: Próbka badana Detektor, Obróbka sygnału, Transformację Fouriera widma interferencyjnego Źródło promieniowania IR (polichromatyczne) Wzorzec Interferencyjne widmo IR

Spektroskopia wibracyjna w podczerwieni z zastosowaniem transformaty Fouriera (spektroskopia FTIR) http://www.darewit.pl/dane-techniczne---wykresy---jak-grzeja-zarowki-.html 0,01nm 1nm 100nm 400nm 800nm 1mm 1m Bliska podczerwień (NIR – near InfraRed) Średnia podczerwień (MIR – mid InfraRed) Daleka podczerwień (FIR – far InfraRed) Długość fali λ [μm] 0,8-2,5 2,5-25 25- 1000 Liczba falowa ν [1/cm]* * ν [1/cm]*= 1000/ λ [μm] 12500-4000 4000-400 400-20 w których podczas wibracji zmienia się moment dipolowy - (1500- 3700 [cm-1]) analiza grup funkcyjnych biocząsteczek, (700 – 1500[cm-1]) obszar daktyloskopowy – analiza biocząsteczek, analiza drgań wiązań między atomami w cząsteczce (analiza widm oscylacyjnych)

Rodzaje drgań cząsteczkowych Drgania rozciągające Symetryczne Asymetryczne Drgania deformacyjne W płaszczyźnie Kołyszące Nożycowe Poza płaszczyzną Wachlarzowe Skręcające http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/molspec/irspec1.htm

Widmo charakterystyczne dla komórki: Literatura: Stuard,2004; Socrates Group, 2004 Białka: Amid Irz (1654 cm-1) 80% C=O rozciąganie, 10% C- N rozciąganie, 10% N-H rozciąganie Amid IIrz (1567cm-1) 60% N–H rozciąganie; 40% C–N rozciąganie Amid IIIrz (1299 cm-1) 30% C–N rozciaganie; 30% N–H zginanie; 10% C=O rozciąganie; 10% O=C–N zginanie; 20% inne Lipidy (2850cm-1 – 3010cm-1) Symetryczne i asymetryczne rozciągania grup CH3, CH2,=C-H Kwasy nukleinowe (950cm-1-1250cm-1) 1244 cm-1 – asymetryczne rozciąganie PO2 w RNA 1230 cm-1 – asymetryczne rozciąganie PO2 w DNA 1089 cm-1 – symetryczne rozciąganie PO2 w DNA 1084 cm-1 – symetryczne rozciąganie PO2 w RNA Cukry: 1155 cm-1, 1032 cm-1 – rozciąganie –C-O

Blastocysta gr. blastós – kiełek, zarodek, kýstis – pęcherz - to stadium rozwojowe zarodka ssaków łożyskowych gotowe do zagnieżdżenia w macicy. http://www.ramsem.com/embryolocal.html http://www.youtube.com/watch?v=nkAIfrTQELA

Blastocysta - pierwsze stadium rozwojowe z wyróżnionymi częściami zarodka http://elinow-bioreview2.wikispaces.com/Stages+of+Embryo http://www.independent.com/news/2009/nov/21/showtime-stem-cells/ (pierwotna jama ciała) (węzeł zarodkowy, embrioblast) Komórki macierzyste dla zarodka właściwego Komórki macierzyste dla łożyska W warunkach in vitro na tym etapie bardzo często występuje zahamowanie rozwoju zarodka.

Dojrzałość oocytu (komórki jajowej) jest podstawowym warunkiem jego zdolności do zapłodnienia i prawidłowego rozwoju zarodkowego, a następnie płodowego. Podczas dojrzewania in vitro ponad 80% oocytów osiąga stadium metafazy II (MII) (osiąga dojrzałość mejotyczną). Z kolei, 70−80% w pełni dojrzałych oocytów jest zdolnych do zapłodnienia. Z nich tylko 50% rozwija się do stadium blastocysty podczas hodowli in vitro [Mermillod i in., 1999; Kątska-Książkiewicz i in., 2007]. Jednym z czynników ograniczających zdolności rozwojowe oocytów in vitro może być ich nieprawidłowe dojrzewanie, spowodowane suboptymalnymi warunkami hodowli [Moor i in., 1998]. Oocyt II rzędu (stadium MII) Oocyt I rzędu (stadium MI) http://panorama.varsovia.pl/varsovia/warstwy/dna/ha/oocyt-GV.html

zaobserwowano wzrost liczby dojrzałych oocytów dla stężenie 0,07% HA Instytut Zootechniki w Balicach – prowadzi badania wpływu hialuronianu na kompetencje rozwojowe oocytów. Hialuronian jest produkowany w warunkach in vivo w komórkach sąsiadujących (komórki wzgórza jajonośnego) z oocytem. Hialuronian (HA) – glikozoaminoglikan (polisacharyd): Nie tworzy kowalencyjnego wiązania z białkami, nie może więc wchodzić w skład typowego proteoglikanu. Może natomiast stanowić oś, na której wiążą się inne proteoglikany tworząc wraz z nimi "agregat proteoglikanu". Wchodzi w skład macierzy zewnątrzkomórkowej. [ Laurent T.C., J. R.E. Fraser (1992) The FASEB Journal vol. 6 no. 7 2397-2404 ] Na podstawie wstępnych badań [E.Latasiewicz, J.Opiela, Wiadomości Zootechniczne R. XLIX (2011) 4:3-7]: zaobserwowano wzrost liczby dojrzałych oocytów dla stężenie 0,07% HA nie zaobserwowano wpływu na wzrost fragmentacji DNA (HA nie przyspiesza apoptozy)

Materiał badawczy Materiał badawczy dostarczony z Instytutu Zootechniki, Balice – dr inż. Jolanta Opiela Blastocysty bydlęce (utrwalone) Blastocysta uzyskana z zapłodnienia oocytu hodowanego bez HA; blastocysta hodowana w pożywce SOF2 Blastocysta uzyskana z zapłodnienia oocytu hodowanego bez HA; blastocysta hodowana we współhodowli z komórkami Vero w pożywce B2 Kontrola doświadczenia Materiał - cel badania Blastocysta, uzyskana z zapłodnienia oocytu hodowanego z dodatkiem hialuronianu HA (12,5 μl 1% HA / ml pożywki IVM) (Vk= 0,007%)

Cel badań Określenie wpływu dodatku hialuronianu (HA) do pożywki do dojrzewania oocytów bydlęcych na ich kompetencje rozwojowe. Odpowiedź na pytania: Czy zastosowanie laboratoryjnego źródła promieniowania IR i detektora FPA pozwoli na zobrazowanie i analizę komórek zarodkowych w stadium blastocysty? Czy metody spektroskopowe mogą stanowić uzupełnienie testów biochemicznych w badaniach zarodków?

Metoda i urządzenia pomiarowe SPEKTROSKOPIA W ZAKRESIE PODCZERWIENI Z ZASTOSOWANIEM TRANSFORMATY FOURIERA Miejsce: laboratorium SISSI (Source for Imaging and Spectroscopic Studies in the Infrared) synchrotron ELETTRA, Triest, Włochy Data pomiaru: 08-14. 07.2011 Źródło IR: Laboratoryjne Globar Interferometr - Bruker VERTEX70 Mikroskop Vis/IR- Hyperion 3000 Detektor: Focal Plane Array (FPA, 64 x 64 piksele) 15xobjektyw: 1 pixel= 2,65 μm Rozmiar obrazowanego obszaru próbki: 170 μm x 170 μm Zakres spektralny: 900 cm-1 – 4000 cm-1 Rozdzielczość spektralna: 4 cm-1 Liczba skanów: 64

Dwuwymiarowe mapy rozkładu intensywności wybranych pasm absorpcji: Blastocysta ze współhodowli kontrolna (KV) Blastocysta kontrolna (K) Blastocysta (H) DNA (1250cm-1- 950cm-1) Amidy I i II rz (1715cm-1-1400cm-1)

Dwuwymiarowe mapy rozkładu intensywności wybranych pasm absorpcji: Blastocysta ze współhodowli Vero kontrolna (KV) Blastocysta kontrolna (K) Blastocysta (H) Białka, lipidy (1400cm-1-1300cm-1) Lipidy (3020cm-1-2880cm-1)

Analiza danych Dla każdej blastocysty wyekstrahowano po 40 widm komórek z rejonu węzła zarodkowego Analizowany zakres widma: 900cm-1 – 1850cm-1 Wykonano korektę ze względu na rozpraszanie fali elektromagnetycznej na przedmiotach sferycznych o wielkości porównywalnej do długości fali (Mie scattering, P. Bassan, University of Manchester, UK) Przeprowadzono normalizację wektorową.

Hierarchiczna analiza klastrowa: Zastosowane metody wielowymiarowej analizy wariancji: Hierarchiczna analiza klastrowa: - optymalne grupowanie obserwacji (obiekty podobne znajdują się w obrębie jednego klastra) metoda Warda: analiza wariancji; zmierza do minimalizacji sumy kwadratów odchyleń dwóch dowolnych skupień Miarą odległości lub rozbieżności między obiektami jest odległość euklidesowa = rzeczywista odległość geometryczna między obserwacjami w przypadku dwóch lub trzech wymiarów

Numery widm komórek badanych blastocyst Hierarchiczna analiza klastrowa z zastosowaniem metody Warda (dendrodiagram) K - kontrola (40 widm) KV – kontrola +Vero (40 widm) H – blastocysta (40widm) Numery widm komórek badanych blastocyst Odległość wiązania [a.u.] Diagram drzewa Metoda Warda Odl euklidesowa

Zastosowane metody wielowymiarowej analizy wariancji: Analiza składowych głównych (ang. Principal Component Analysis, PCA): - PCA pozwala na wizualizację danych oraz analizę wielowymiarowych danych poprzez ich kompresję    zredukowanie liczby czynników losowych; zmienne losowe w danej grupie stają się od siebie zależne wykrywanie struktury w związkach między zmiennymi - klasyfikacja zmiennych poprzez znalezienie składowych głównych (PC), które opisują wariancję; Określenie zależność między głównymi składowymi a danymi na podstawie analizy ładunków czynnikowych

Analiza składowych głównych (ang. Principal Component Analysis, PCA ) Projekcja próbek na przestrzeń zdefiniowaną przez trzy czynniki główne (obok czynników głównych podano procent opisanej wariancji danych przez każdy czynnik)

Analiza składowych głównych (ang. Principal Component Analysis, PCA ) Ładunki czynnikowe to korelacje między zmiennymi a czynnikami PC Wartości ładunków czynnikowych [j.u.] Liczba falowa [1/cm] (92,7%) (5,8%) (1,2%) Amid IIIrz Amid IIrz Amid Irz

Analiza pików charakterystycznych dla biomolekuł: Amid IIrz (1462 rozciąganie C-N, 1544 zaginanie wiazania N-H) Średnie widma komórek blastocyst Amid Irz (1654) 80% C=O rozciąganie, 10% C- N rozciąganie, 10% N-H rozciąganie Lipidy, Amidy IIIrz (1357) asymetryczne i symetryczne, nożycowe drgania w C-H w wiązaniu CH3 Rejon DNA (950-1250) Literatura: Stuard,2004; Socrates Group, 2004

Pola powierzchni pod pikami [j.u.] Analiza pików charakterystycznych dla biomolekuł Kompetencje rozwojowe oocytu są zależne od jakościowego i ilościowego składu cytoplazmy. Intensywność pików świadczy o ilościowej zawartości biokomponentów w komórkach blastocyst Pola powierzchni pod pikami [j.u.] Amid IIIrz, lipidy, (1357cm-1) ±SD Amid IIrz (1462cm-1) (1544cm-1) Amid Irz (1654cm-1) Suma pól pod pikami Suma pól pod pikami (bez Amidu IIrz) Kontrola 10 x 10-4 ±0,5 x 10-4 50 x 10-4 4,4 x 10-4 30 x10-4 0,8 x 10-4 47 x10-4 1,5 x 10-4 138 x10-4 18,4 x 10-4 87 x10-4 blastoHA 16 x10-4 1,2 x 10-4 62 x10-4 13,5 x 10-4 25 x10-4 2,7 x 10-4 3,0 x 10-4 134 x10-4 20,2 x 10-4 71 x 10-4 7,1 x 10-4 Blasto+ Vero 18 x 10-4 1,7 x 10-4 92 x10-4 20,7 x 10-4 24 x10-4 3,4 x 10-4 34 x10-4 4,6 x 10-4 168 x10-4 34,1 x 10-4 72 x10-4 8,0 x 10-4

DNA (asymetryczne rozc PO2-) Analiza pasm charakterystycznych dla biomolekuł: α helisa β struktura = A(1654cm-1) A(1635cm-1) Analiza struktury drugorzędowej białek (jakościowa analiza, pozwala wnioskować o zmianach konformacyjnych w białkach): Kontrola = 1,23 Blasto (HA) = 1,04 Blasto +Vero= 1,11 Analiza stosunku kwasów nukleinowych (określenie intensywności procesów replikacji DNA czy transkrypcji RNA): RNA (uracyl) DNA (asymetryczne rozc PO2-) = A(996cm-1) A(1230cm-1) Kontrola = 0,56 Blasto (HA) = 0,35 Blasto +Vero= 0,26

Podsumowanie Zastosowanie źródła laboratoryjnego IR i detektora FPA pozwala obrazować pasma charakterystyczne dla danej biomolekuły (np. DNA, białek) obecnej w komórkach blastocyst bydlęcych. Na tej podstawie można wnioskować jaki jest rozkład danej biomolekuły np. intensywność pasma DNA - gdzie jest najwięcej komórek lub jaki jest rozkład materiału zapasowego – lipidy, białka. Możliwe jest wyekstrahowanie widm pojedynczych komórek i przeprowadzenie analizy m.in. statystycznej w celu zbadania czy istnieją różnice pomiędzy komórkami w badanych blastocystach. Na podstawie hierarchicznej analizy klastrowej oraz analizy składowych głównych (PCA) można wnioskować, że komórki blastocysty, której oocyt był hodowany w pożywce z hialuronianem są bardziej podobne do komórek blastocysty pochodzącej ze współhodowli Vero niż do komórek blastocysty kontrolnej.

Podsumowanie Na podstawie analizy pól powierzchni pod pikami możliwe jest przeprowadzenie ilościowej analizy głównych biomolekuł. Komórki blastocysty hodowanej we współhodowli Vero posiadają ilościowo największe zasoby biomolekuł, głównie Amidu IIrz. Jeśli wykluczymy Amidy IIrz, wówczas komórki blastocysty, której oocyt był hodowany w pożywce z hialuronianem posiadają podobne ilości biomolekuł w porównaniu do blastocyst hodowanych we współhodowli Vero oraz jednocześnie mniejsze zasoby biomolekuł w porównaniu do komórek blastocysty kontrolnej. Określenie drugorzędowej struktury białek pozwala wnioskować o zmianach konformacyjnych w białkach, co może mieć znaczenie w badaniu rozwoju blastocyst. Stosunek α helisy do β struktury jest porównywalny dla wszystkich komórek blastocyst. Analiza ilościowa kwasów nukleinowych pozwala określić intensywność procesów replikacji DNA czy transkrypcji RNA, co może mieć znaczenie w procesach dojrzewania oocytów. Wartości stosunków RNA/DNA są porównywalne, co może świadczyć o tym, że intersywne procesy transkrypcji nie rozpoczęły się jeszcze, komórki blastocyst korzystają z substancji „odziedziczonych” od oocytów.

Podsumowanie W celu wyciągnięcia ostatecznych wniosków na temat wpływu hialuronianu na kompetencje rozwojowe oocytów potrzebne są dalsze badania oraz korelacja danych uzyskanych metodą spektroskopii FTIR z danymi uzyskanymi metodami biochemicznymi.

Podziękowania Dr inż. Jolanta Opiela – Instytut Zootechniki, Balice Mgr inż. Ewelina Lipiec – IFJ PAN, Kraków Dr Lisa Vaccari Dr Giovani Birarda Synchrotron ELLETRA, Triest

Dziękuję Państwu za uwagę