Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) Cytometria – metoda pomiaru właściwości fizycznych i chemicznych pojedynczych komórek lub obiektów biologicznych (jądra komórkowe, mitochondria, chloroplasty) 2 rodzaje cytometrów przepływowych: analizator sorter

Historia: 1934 – publikacja opisująca metodę liczenia komórek przepływających w kapilarze (czujnik fotoelektryczny) 1947 – pierwsze doniesienie o cytofluorymetrycznej detekcji bakterii w aerozolach (badania sponsorowane przez armię USA) urządzenie: detekcja w komorze przepływu w ciemnym polu – oświetlenie światłem widzialnym – detekcja cząstek o średnicy 0.6um 1953 – Wallace Coulter patentuje urządzenie do liczenia krwinek w strumieniu cieczy (wykorzystuje czujnik fotoelektryczny i zasadę ogniskowania hydrodynamicznego)

Budowa cytometru

Część hydrauliczna transportuje obiekty w strumieniu cieczy do komory pomiarowej zapewnia oddzielny przepływ pojedynczych obiektów ogniskuje przepływające obiekty w środku wiązki lasera

Część hydrauliczna (ogniskowanie hydrodynamiczne) zawiesina próbki zawiesina obiektów jest wtłaczana w otoczce płynu osłaniającego do dyszy płyn osłaniający płynie szybciej od centralnego strumienia próbki przepływ laminarny centralnego strumienia (o średnicy ok. 30um) umożliwia przepływ pojedynczych obiektów przed optoelektronicznymi układami rejestrującymi płyn osłaniający

Część hydrauliczna szybkość przepływu 12 – 300 ul/min. szybkość akwizycji 300 – 50 000 komórek/s szybkość akwizycji zależy od gęstości obiektów !

Układ optyczny

Fluorescencja w układzie optycznym Emisja fotonu następuje wtedy, kiedy elektron powraca z wyższej (stan wzbudzenia) orbity na niższą (stan spoczynku)

Fluorescencja w układzie optycznym Prawo Stokes’a długość fali emisyjnego promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większa od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję Przesunięcie Stokes’a - różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji Stokes Shift is 25 nm Cząsteczka fluoresceiny 495 nm 520 nm Intensywność fluorescencji Długość fali

Rodzaje stosowanych fluorochromów autofluorescencja NADPH, chlorofil, melanina, kolagen, tyrozyna, tryptofan białka wykazujące fluorescencję GFP i jego odmiany: EGFP, ECFP, EYFP DsRed 3. aromatyczne związki organiczne fluoresceina, rodamina, Cy3, DAPI, Alexa Fluor 4. kropki kwantowe http://www.microscopyu.com

Budowa kropek kwantowych rdzeń – selenid kadmu lub telurid kadmu powłoka siarczkowo-cynkowa powłoka polimerowa (umożliwia uzyskanie rozpuszczalności w wodzie, pozwala na koniugowanie nanokryształu z p.ciałem, nukleotydem, streptawidyną; PEG pełni funkcję łącznika) cząsteczka biologiczna Molecular Probes

Właściwości kropek kwantowych: rozmiar zbliżony do dużego białka jednakowe spektrum absorpcji rozmiar kryształu determinuje barwę emisji silna fluorescencja ‘wypalanie’ barwnika nieznaczne Molecular Probes

najczęściej wykorzystywane lasery: argonowy – niebieski (488nm) Układ optyczny najczęściej wykorzystywane lasery: argonowy – niebieski (488nm) diodowy – czerwony (635nm) analiza: zielony, żółty, czerwony, daleki czerwony

Układ optyczny rodzaje filtrów górnoprzepustowy dolnoprzepustowy pasmowy

Układ optyczny analizowanie obiektów barwionych kilkoma fluorochromami → spektra emisyjne nakładają się kompensacja – proces polegający na eliminacji nakładających się zakresów emisji

Układ elektroniczny przetwarza sygnał analogowy na cyfrowy pomiar wielkości napięcia przeprowadza kompensację

Wykresy dwuwymiarowe konturowy – zawiera dodatkową informację (3 wymiar) o ilości zdarzeń posiadających określone parametry x-y rozproszenia – 2 parametry jednocześnie, każda oś oznacza intensywność, każda kropka – 1 zdarzenie gęstości – kolor oznacza akumulację określonych zdarzeń

histogram 3-D – oś Z oznacza ilość zdarzeń histogram – pojedynczy parametr a ilość zdarzeń

Określone populacje (spełniające zadane kryteria) obiektów mogą zostać wyselekcjonowane i oddzielone od innych przez bramkowanie zastosowanie w mieszanych populacjach obiektów do analizy określonych parametrów lub w sortowaniu do uzyskania homogennej populacji

(forward scatter) - wielkość SSC (side scatter) - ziarnistość Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii laser detektor przedni FSC (forward scatter) - wielkość detektor boczny SSC (side scatter) - ziarnistość Purdue University Cytometry Laboratories

SSC Laser FSC Rozproszenie na wprost Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni- granulacja komórek i obecność struktur komórkowych SSC Detektor rozproszenia na wprost – informacja o wielkości komórki lub cząsteczki badanej Laser FSC Rozproszenie na wprost Określa wielkość komórki Mierzone wzdłuż osi padającego lasera na wprost Rozproszenie boczne—światło lasaerowe odbite i rozproszone Określa gęstość i liczbę ziarnistości (względnie) Mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej

Rozproszenie na wprost (FSC) Wielkość Laser mała ~ mały FSC Laser duża ~ wysoki FSC

Zasady analizy FACS – analiza ziarnistości i wielkości NEUTROFILE FSC MONOCYTY 200 400 600 800 1000 90 Degree Scatter LIMFOCYTY SSC Purdue University Cytometry Laboratories

detektory fluorescencji Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii– analiza fluorescencji detektor przedni laser komórek Ilość Fluorescencja detektory fluorescencji (PMT3, PMT4 etc.) Purdue University Cytometry Laboratories

Zasady analizy FACS – analiza fluorescencji żółta fluorescencja zielona fluorescencja Purdue University Cytometry Laboratories

Zasady sortowania metodą FACS na zasadzie mechanicznego wychwytu wybranej populacji obiektów przez kapilarę poruszającą się ruchem wahadłowym w strumieniu cieczy (‘catcher-tube sorting’) słaba wydajność (300 komórek/s) duże rozcieńczenie sortowanych obiektów

Zasady sortowania metodą FACS sortery kroplowe – wykorzystują drgania kryształu piezoelektrycznego powodującego rozerwanie strumienia cieczy w komorze przepływu na pojedyncze krople w zależności od posiadanego ładunku na powierzchni obiekty są odchylane w polu elektrycznym (wytwarzanym przez płytki odchylające) do odpowiednich probówek możliwość sortowania do 4 różnych populacji jednocześnie szybkość sortowania do 70 000 komórek/s

kryształ piezoelektryczny

Wykorzystanie ocena subpopulacji limfocytów (niedobory immunologiczne, ocena skuteczności immunosupresji) oznaczanie antygenów HLA (transplantologia) oznaczanie antygenów HLA B27 (ocena schorzeń autoimmunologicznych) ocena stopnia degranulacji bazofilów i poziom limfocytów Th1 i Th2 (alergologia) identyfikacja mutacji chromosomalnych np. chromosom Filadelfia (cytogenetyka) sortowanie komórek macierzystych (przeszczepy) sortowanie gamet męskich z chromosomem X i Y (zapłodnienie pozaustrojowe)

Przykład zastosowania Zawartość DNA w komórkach w hodowli asynchronicznej barwienie jodkiem propidyny – PI, pozwala ocenić fazy cyklu komórkowego Count 200 400 600 800 1000 G0 / G1 S G2 / M zawartość DNA 2N 4N G2 M G0 G1 S

HISTOGRAM DNA pik G0-G1 odpowiada ilości DNA = 2n w fazie G0 i G1 G2-M obszar S to rozkład zawartości DNA w fazie S cyklu komórkowego ilość komórek S pik G2-M odpowiada ilości DNA = 4n w fazie G2 i M intensywność fluorescencji PI

Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

Mikroskopia konfokalna Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. http://www.microscopyu.com/tutorials/java/virtual/confocal/index.html

Dekonwolucja w mikroskopii Zaawansowana technika komputerowej obróbki obrazu mikroskopowego (w formie stosów obrazów – tj. przekrojów w różnych płaszczyznach ostrości) pozwalająca na wyeliminowanie zakłóceń pochodzących z innych płaszczyzn optycznych http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/deconvolution/deconintro.html http://micro.magnet.fsu.edu/primer/digitalimaging/deconvolution/deconalgorithms.html