ARE a czasowa aktywacja genów zależnych od NF-κB mgr Marta Iwanaszko Silesian University of Technology Gliwice 2010

2 Plan wystąpienia  Wprowadzenie do zagadnienia  Motywacja, dane, narzędzia  Wyniki

3 NF-κB Rodzina NF-κB odgrywa ważną rolę we wczesnej odpowiedzi immunologicznej, a także ma wpływ na inne ważne procesy takie jak aktywacja cyklu komórkowego, czy apoptoza. Po stymulacji przez patogen aktywowana jest kaskada kinaz, której efektem jest uwolnienie NF-κB poprzez odłączenie molekuły inhibitora (IκBα). Aktywny NF-κB przedostaje się z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie uczestniczy w aktywacji procesu transkrypcji zależnych genów.

4 Klasyfikacja genów zależnych od NF-κB Based on the TNF-stimulation experiment, conducted at the UTMB at Galveston, NF-κB-dependent genes can be categorized, based on the timing of their activation counted from NF-κB translocation into the nucleus as: early, middle and late genes. Red color indicates high expression Tian et al. (2005)

5 Klasyfikacja genów zależnych od NF-κB GrupaFunkcja Wczesne (Early) cytokiny czynniki transkrypcyjne sygnałowa Średnie (Middle) receptory powierzchniowe metaboliczna sygnałowa antyapoptotyczna Późne (Late) receptory receptory powierzchniowe sygnałowa czynniki transkrypcyjne

6 Czasowa aktywacja genów Nie jest oczywiste jaki mechanizm odpowiada za podział genów ze względu na czas odpowiedzi transkrypcyjnej. Hipotezy próbujące wytłumaczyć ten proces:  Hipoteza kofaktorów (Paszek et al. 2005)  Hipoteza aminokwasowo specyficznej fosforylacji (Nowak et al. 2008)  Teoria oparta o stabilność mRNA (Hao & Baltimore 2009)

7 Czasowa aktywacja genów „ The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules” S. Hao and D. Baltimore (2009) Analiza ekspresji genów i ich czasowej aktywacji wywołanych przez TNF w mysich fibroblastach i macrofagach BMD (Bone-Marrow-Derived). Pod uwagę zostały wzięte wyłącznie geny stymulowane (upregulation) przez TNF. Stymulowane geny można podzielic na 3 grupy, charakteryzujące się czasem szczytu ekspresji mRNA. Stabilność mRNA jest różna dla danej grupy i jest powiązana z obecnością ARE w 3’ UTR (obszar nieulegający translacji).

8 3’ Untranslated Region W obszarze 3'UTR mogą się znajdować różne sekwencje sygnałowe: sekwencje będące sygnałem do poliadenylacji sekwencje wpływające na lokalizację mRNA w komórce sekwencje wpływające na stabilność mRNA (np. sekwencje ARE bogate w adeninę i uracyl) sekwencje wpływające na translację miejsca wiązania miRNA

9 AU – rich elements (ARE) KlasaCharakterystyka ARE I Kilka rozproszonych kopii pentameru AUUUA ARE II Przynajmniej dwa pokrywające się motywy UUAUUUA(U/A)(U/A) ARE III Regiony bogate w AU, ale nie zdefiniowane jako motyw AUUUA ARE to region w sekwencji mRNA, w którym często występują nukleotydy A (adenina) i U (uracyl), który wskazuje mRNA do degradacji. Szacuje się, ze 5-8% ludzkiego mRNA zawiera ARE, szczególnie w mRNA cytokin i czynników transkrypcyjnych, gdzie oznaczają sekwencje przeznaczone do szybkiej destrukcji.

10 ARE a czasowa aktywacja genów S. Hao and D. Baltimore (2009)

11 Motywacja Analiza zestawu genów zależnych od NF-κB przedstawionego w pracy Tiana i in. (2005) pod względem występowania elementów ARE w 3’ UTR. Motywy:  ATTTA  WATTTWW / WWATTTW  WWATTTAWW  ARE III,

12 Dane, narzędzia  Gatunki:  człowiek, szympans, mysz, krowa.  Geny:  Podzbiór genów zależnych od NF-κB (40 genów, reprezentujące grupy: early, middle, late) zaprezentowanych w pracy Tian in. (2005)  Aplikacje:  UCSC Genome Browser  NucleoSeq  Matlab

13 Analiza wyników klasyfikacji Gene Classification based on ARE count (mRNA stability) Classification based on expression pattern (Tian et al.) PTGS2Early CXCL1Early CXCL2Early IL6Early TNFAIP3Early NFKBIA (IkBa) Early IRF1Early Geny występujące w obu zestawach genów (Hao & Baltimore, Tian i in.) Gene Classification based on ARE count (mRNA stability) Classification based on expression pattern (Tian et al.) ICAM1Middle/ LateLate CCL20Middle/ EarlyEarly IFNGR2Middle NFKBIEMiddle RELBMiddle TNFAIP2Middle TAPBPLate

14 Wyniki: ARE III Human Mouse Chimp Cow LateMiddleEarly

15 Wyniki: ARE III 1 Wczesne: mean= 8,142 2 Późne: mean= 2,091 3 Średnie: mean= 5,056

16 Wyniki: ARE I (‘ATTTA’) Human Mouse Chimp Cow LateMiddleEarly

17 Wyniki : ARE I (‘ATTTA’) 1 Wczesne: mean= Późne: mean= Średnie: mean= 2.667

18 Wyniki: ARE II (‘WWATTTAWW’) Human Mouse Chimp Cow LateMiddleEarly

19 Wyniki: ARE II (‘WWATTTAWW’) 1 Wczesne: mean= Późne: mean= Średnie: mean= 0.500

20 Problemy do rozwiązania  Uzyskanie prawidłowych sekwencji 3’ UTR dla wszystkich rozpatrywanych gatunków,  Wybór najlepszego motywu do poszukiwania ARE, tak by umożliwiał on najlepsze zróżnicowanie grup genów w zależności od czasowej aktywacji transkrypcji  Okreżlenie poziomu korelacji pomiędzy znaczeniem struktury regionu promotora rozpatrywanych genów, a zawartością ARE w 3’ UTR.  Rozszerzenie zestawu genów poddawanych analizie.

21 Podziękowania  Prof. Marek Kimmel, W.M. Rice University, Houston  Prof. David Wheeler, BCM, Houston  Prof. Allan R. Brasier, UTMB, Galveston

22 Dziękuję za uwagę

23 Results: Differences in promoter structure  General cross-species sequence conservation is higher between the early genes than between the late genes Human IκBαHuman PTGES Early genes representative Late genes representative