Institute of Automation Silesian University of Technology Gliwice, Poland Roman Jaksik Anna Lalik Andrzej Michalski Joanna Rzeszowska-Wolny

Budowa glikanów produkowanych w procesie glikozylacji jest uzależniona od tzw. kodu biosyntetycznego - zestawu różnorodnych biosyntetycznych reakcji katalizowanych przez enzymy – glikotransferazy. 98 genów glikotransferaz (GT) 42 reakcje glikozylacji Ponad 10,000 różnych struktur glikanów Na podstawie informacji o poziomie ekspresji genów GT powinno być możliwe określenie zestawu struktur pojawiających się z największym prawdopodobieństwem. Eksperymentalne określenie koncentracji poszczególnych glikanów jest aktualnie niezwykle trudnym zadaniem. Pojawienie się „osobliwych” glikanów na powierzchni komórki jest wykorzystywane w diagnostyce, gdyż stanowią one znacznik (marker) komórek nowotworowych, ich obecność często świadczy o szybkim rozwoju choroby.

Informacje o budowie znanych glikanów Informacje o budowie znanych glikanów Informacje o ekspresji genów glikotransferaz Informacje o ekspresji genów glikotransferaz Zestaw struktur glikanów predykcja (Kawano et al. 2005)

Struktury glikanów opisane w bazie danych KEGG Glycan rozbito na pojedyncze pary monosacharydów połączonych określonym wiązaniem ENTRY G00001 Glycan NAME N-Acetyl-D- glucosaminyldiphosphodolichol COMPOSITION (GlcNAc)1 (PP-Dol)1 MASS (PP-Dol) REMARK Same as: C04500 REACTION R05969 R05970 PATHWAY ko00510 N-Glycan biosynthesis ko01100 Metabolic pathways ENZYME NODE 2 1 PP-Dol GlcNAc -4 0 EDGE 1 1 2:a1 1 /// Baza danych KEGG Glycan | GlcNAc a1 PP-Dol | GlcNAc b1-4 GlcNAc | Man b1-4 GlcNAc | G00001 | 1 | 0 | 0 | G00002 | 1 | 1 | 0 | G00003 | 1 | 1 | 1 |.... Macierz reakcji | GlcNAc a1 PP-Dol | GlcNAc b1-4 GlcNAc | Man b1-4 GlcNAc | GlcNAc a1 PP-Dol | 1 | | | GlcNAc b1-4 GlcNAc | | 1 | | Man b1-4 GlcNAc | | | 1 |.... Macierz korelacji Budowa bazy danych Dla każdej struktury zliczono ilość wystąpień każdej możliwej pary Pomiędzy każdymi dwiema parami monosacharydów obliczono miarę podobieństwa (Cosine) określającą jak często dane dwie pary wiązań występują razem w jednym glikanie

Informacje o budowie znanych glikanów Informacje o budowie znanych glikanów Informacje o ekspresji genów glikotransferaz Informacje o ekspresji genów glikotransferaz Zestaw struktur glikanów predykcja (Kawano et al. 2005)

EntrezGeneID | K562 0h.1 | K562 0h.2 | K562 24h.1 | | 5.98 | 6.01 | 6.31 | | 5.63 | 5.27 | 5.35 | 2527 | 4.17 | 4.46 | 4.28 | 6482 | 3.63 | 3.60 | 3.60 |.... | fold change | p-value | EntrezGeneID | K562 0h/C | K562 24h/C | K562 0h/C | K562 24h/C | | | | | | | | | | | | | | | |.... przetworzone dane ekspresyjne geny GT o zmienionym poziomie ekspresji LFuc a1-3 GlcNAc GlcNAc b1-3 Gal GlcNAc b1-4 Man Gal b1-4 Xyl GlcNAc b1-4 Man.... lista reakcji katalizowanych przez stymulowane geny surowe dane ekspresji genów K562 K.1K562 0h.1 K562 K.2K562 0h.2 K562 24h.1K562 24h.2 Ekspresja genów glikotransferaz (GT) Ekspresje genów GT zmierzono za pomocą 6 mikromacierzy oligonukleotydowych dla komórek nowotworowych poddanych działaniu 4Gy promieniowania jonizującego. Dane poddano niestandardowemu przetwarzaniu dzięki któremu określono grupę genów GT których ekspresja zmienia się w sposób znamienny statystycznie na skutek promieniowania. Na podstawie informacji z literatury określono jakie wiązania katalizowane są przez glikotransferazy będące produktem wybranych genów

Informacje o budowie znanych glikanów Informacje o budowie znanych glikanów Informacje o ekspresji genów glikotransferaz Informacje o ekspresji genów glikotransferaz Zestaw struktur glikanów predykcja (Kawano et al. 2005)

Dla każdej struktury w oparciu o macierz podobieństwa miedzy parami glikotransferaz obliczany jest współczynnik predykcji Współczynnik predykcji LFuc a1-3 GlcNAc GlcNAc b1-3 Gal GlcNAc b1-4 Man Gal b1-4 Xyl GlcNAc b1-4 Man... | GlcNAc a1 PP-Dol | GlcNAc b1-4 GlcNAc | GlcNAc a1 PP-Dol | 1 | | GlcNAc b1-4 GlcNAc | | 1 | Man b1-4 GlcNAc | | |... …

Współczynnik predykcji S C (qi,bj)–współczynnik korelacji pomiedzy wiązaniami katalizowanymi przez glikotransferaze qi oraz element badanej struktury bj Eg(qi) – poziom ekspresji genu qi n – liczba genów GT analizowanych za pomocą mikromacierzy m – liczba wiązań w aktualnie analizowanej strukturze 1 2

Expression level GT gene Zmiany ekspresji genów GT – K562

procent struktur jakie zostały zidentyfikowane na określonym miejscu 4036 elementów listy predykcyjnej lub ponad nim Weryfikacja metodą leave-one-out Specyficzności algorytmu zweryfikowano metodą leave-one-out tworząc macierz podobieństwa dla wszystkich struktur poza jedną która użyta została jako wzorzec reakcji w miejsce reakcji katalizowanych przez zbiór genów glikotransferaz.

1st rank Structure: G04183 Score: 2,404 2nd rank Structure: G04804 Score: 2,389 3rd rank Structure: G05226 Score: 2,389 3 struktury o największym współczynniku predykcji tj. o największym prawdopodobieństwie pojawiania się na powierzchni badanych komórek w wyniku działania promieniowania jonizującego wg. zastosowanej metody

Do charakterystyki glikanów na powierzchni komórki użyto lektyn znakowanych barwnikiem fluoroscencyjnym oraz czytnika mikropłytek mierzącego poziom fluorescencji. LektynaSpecyficznośćFC 24h GSL-Iα-D-GalNAc0,64 WGA(dGlcNAc)2NeuNAc1,23 UEA-IFucose1,34 Badanie wykonano 24 godziny po poddaniu komórek działaniu promieniowania jonizującego. LektynaSpecyficznośćFC 24h ConAα-D-Man>α-D-Glc1,49 LCAα-D-Man1,22 PSAβ-D-Man0,79 RCAβ-D-Galaktoza0,9 PNAβ-D-Gal(1–3)-D-GalNAc1,23 DBAα-D-GalNAc; (1–3)GalNAc0,91 GSL-Iα-D-GalNAc0,64 WGA(dGlcNAc)2NeuNAc1,23 UEA-IFucose1,34 Zmiany na poziomie glikanów określone za pomocą znakowanych lektyn nie odzwierciedlają bezpośrednio zmian na poziomie transkryptów genów glikotransferaz z uwagi na długi czas potrzebny na ich zsyntetyzowanie. DNAmRNABiałka (GT)Glikany transportglikozylacja translacja transkrypcja ~ 24 godziny

W wielu sytuacjach zestaw glikanów może nie odzwierciedlać teraźniejszego bądź przeszłego stanu transkryptomu z powodu skomplikowanych mechanizmów regulacyjnych pojawiających się na wielu etapach procesu powstawania i transportu glikanów. Planowane udoskonalenia metody: Opracowanie lepszych metod weryfikacji w oparciu o dane uzyskane za pomocą znakowanych lektyn Możliwość definiowania zestawu aktywnych reakcji na podstawie danych innego typu niż mikomacierzowe (np. real-time PCR) Uwzględnienie kinetyki reakcji glikozylacji podczas wyznaczania współczynnika predykcji

Dziękuje za uwagę

Zmiany ekspresji genów GT

K562 Próba GlcManGalGlcNAcGalNAcXylNeu5AcGlcaLFuc 3 rozgałęzienia 4 rozgałęzienia 5 rozgałęzień Zliczenie podjednostek dla struktur w rankingu: 1:10 K h h h Zmiana [%] 09,7-28,6-20,00,0 250,00,0-71,4-42,3-100,00