Funkcjonalne współzależności szlaków sygnałowych zależnych od czynników transkrypcyjnych TP53 i NFkB. Katarzyna Szołtysek

Mechanizm regulacji NFkB, współzależności z TP53

TP53 jako czynnik transkrypcyjny www.brc.riken.jp/.../201p53_network.html

Regulacja aktywacji TP53 MDM2 negatywny regulator p53: wiąże się z domeną TA p53 eksport p53 z jądra komórkowego funkcja ligazy ubikwityny PTEN pozytywny regulator p53: defosforyluje PIP3 (Pi3-4-5P) blokada aktywacji Akt/PKB http://p53.free.fr/index.html

Cel pracy zidentyfikowanie i scharakteryzowanie funkcjonalnych współzależności pomiędzy szlakami sygnałowymi zależnymi od czynników transkrypcyjnych NFkB i TP53 analiza wpływu aktywacji szlaku zależnego od NFkB na przeżycie komórek nowotworowych eksponowanych na czynniki genotoksyczne (promieniowanie UV i promieniowanie jonizujące) analiza profilu ekspresji wybranych genów regulowanych przez czynniki transkrypcyjne NFkB i TP53, w warunkach kontrolnych i w komórkach eksponowanych na czynniki stresu komórkowego identyfikacja genów, na których aktywność mają wpływ oba czynniki transkrypcyjne i opracowanie modelu funkcjonalnych współzależności obu szlaków sygnałowych

HCT116 (rak jelita grubego) Model doświadczalny HCT116 (rak jelita grubego) p53+/+ (wt) p53-/- (bi-allelic knock-out) HCT116 STATUS p53: A – RT-PCR B – Western blot A B

Analiza poziomu ekspresji genów oraz białek TP53 zależnych Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-) Analiza (WB, qRT-PCR): regulacja p53 blokada cyklu komórkowego indukcja apoptozy 7

Analiza poziomu ekspresji genów oraz białek TP53 zależnych Analiza aktywacji badanych ścieżek sygnałowych Indukcja białka p53: A – Western blot A B C Indukcja ścieżki NFkB: B – Western blot C – RT-PCR 8

Analiza poziomu ekspresji genów TP53 zależnych Schemat ścieżki sygnałowej TP53 9

Analiza ekspresji genów regulatorowych, zależnych od TP53 – MDM2 HCT116 p53-/- HCT116

Analiza ekspresji genów regulatorowych, zależnych od TP53 – PTEN HCT116 p53-/- HCT116

Analiza ekspresji genów zależnych od TP53 – p21 HCT116 p53-/- HCT116

Analiza ekspresji genów zależnych od TP53 – Noxa HCT116 p53-/- HCT116

Wnioski: stymulacja komórek TNFa wpływa na aktywację genów zależnych od p53, wywołaną promieniowaniem UV poziom ekspresji MDM2 i PTEN ulega podwyższeniu w obu stosowanych schematach poziom ekspresji p21/WAF1 i Noxa ulega początkowemu obniżeniu, a następnie podwyższeniu w obu stosowanych schematach aktywacji analizowanych ścieżek sygnałowych

Analiza poziomu ekspresji genów NFkB zależnych Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-) Analiza: qRT-PCR PCR Array (SABioscience - NFkB dependent genes)

Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-) Analiza: cDNA 1h

Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-) Analiza: cDNA 1h

Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB Analiza qRT-PCR: BCL3, NFKBIA, REL, IL1A, IL8, TNF, TNFAIP3