Enzymy Ogólne właściwości Kinetyka i inhibicja reakcji enzymatycznych Regulacja aktywności enzymatycznej

Enzymy jako biokatalizatory głównie białka (także RNA – rybozymy, DNA – DNA-zymy) wytwarzane tylko przez żywe komórki (ale mogą działać pozakomórkowo – płyny ustrojowe, tkanki) przyspieszają reakcje biochemiczne, aby zachodziły z dostateczną wydajnością (106-1011 razy) – wysoka efektywność nie zużywają się, nie zmieniają się trwale podczas reakcji działają selektywnie → regulują procesy metaboliczne – wspomagają utrzymanie homeostazy 2

Enzymy jako biokatalizatory nie zmieniają końcowego składu mieszaniny (odtwarzają się po reakcji) nie zmieniają stałej równowagi danej reakcji odwracalnej przyspieszają osiągnięcie równowagi w reakcjach termodynamicznie możliwych zmieniają mechanizm reakcji – tworzą związki przejściowe

Enzymy jako biokatalizatory Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez: lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji, która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają specyficzną rolę w katalizie obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

Nazewnictwo enzymów Nazwy powszechnie używane: oksydaza ksantynowa – (substrat) lipaza (gr. lípos – tłuszcz)‏ rybonukleaza trzustkowa – (źródło) lipaza wrażliwa na hormon – (regulacja) proteaza cysteinowa (mech. działania) pepsyna (gr. pepsis – trawienie)‏ - (funkcja w organizmie) lizozym (od lizujących właściwości wobec bakterii)‏

hydrolaza acetylocholiny oksydoreduktaza alkohol:NAD Nazewnictwo enzymów hydrolaza acetylocholiny katalizowana reakcja przyrostek -aza substrat/y oksydoreduktaza alkohol:NAD

Nazewnictwo enzymów XX.XX.XX.XX 2.6.1.1 Numer EC numer przypisany każdemu enzymowi wg zasad klasyfikacji opracowanej przez Komisję Enzymologiczną Międzynarodowej Unii Biochemicznej IUB, 1961 Enzyme Commission lub Enzyme Catalogue XX.XX.XX.XX klasa . podklasa . podpodklasa . nr w podpodklasie 2.6.1.1 2. -. -.- Transferazy 2. 6. -.- Przenoszące grupy azotowe 2. 6. 1.- Transaminazy (aminotransferases)‏ 2.6.1.1 Transaminaza asparaginianowa

ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji Klasyfikacja enzymów ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji EC 1- Oksydoreduktazy przenoszą ładunki (elektrony i jony H3O+ - protony) z cząsteczki substratu na cząsteczkę akceptora (dehydrogenazy, oksydazy)‏ EC 2 – Transferazy przenoszą daną grupę funkcyjną (tiolową, aminową, itp.) z cząsteczki jednej substancji na cząsteczkę innej substancji (transaminazy, kinazy)‏ EC 3 – Hydrolazy powodują rozpad substratu pod wpływem wody (hydroliza)‏ rozczepienie wiązań C-C, C-O, C-N, innych EC 4 – Liazy powodują rozpad substratu bez hydrolizy rozszczepienie wiązań (C-C, C-O, C-N,inne) przez eliminację atomu i wytworzenie wiązania podwójnego) EC 5 – Izomerazy zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku (geometryczne zmiany w obrębie cząteczki) EC 6 – Ligazy (syntetazy)‏ powodują syntezę (połączenie) różnych cząsteczek; powstają wiązania chemiczne przy udziale energii z ATP

Klasyfikacja enzymów ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji EC 1 – oksydoreduktazy EC 2 – transferazy EC 3 – hydrolazy EC 4 – liazy EC 5 – izomerazy EC 6 – ligazy (syntetazy) ze względu na sposób, w jaki dostają się ne do przestrzeni pozakomórkowej (podział kliniczny) e. wskaźnikowe e. sekrecyjne e. ekskrecyjne

Enzymy wskaźnikowe (indykatorowe)‏ enzymy wewnątrzkomórkowe uwalniane w wyniku uszkodzenia bł. komórkowej lub rozpadu komórki – wzrost aktywności we krwi zawartość enzymu wskaźnikowego w pł. pozakomórkowym jest zależna od: jego ilości w uszkodzonej tkance liczby uszkodzonych komórek i stopnia ich uszkodzenia rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego enzymów przykłady: kinaza kreatynowa (CK) dehydrogenza mleczanowa (LDH) aminotrasferazy asparaginianowa (AspAT) i alaninowa (AlAT)

Enzymy sekrecyjne fizjologicznie wydzielane do pł. pozakomórkowego, np. do krwi tam pełnia swą funkcję - funkcjonalne enzymy osocza niewydolność narządu produkującego i wydzielającego powoduje obniżenie ich aktywności (synteza na rybosomach wątroby)‏ przykłady: czynniki krzepniecia i fbrynolizy esteraza cholinowa lipaza lipoproteinowa

Enzymy ekskrecyjne produkowane przez gruczoły i wydzielane do wydzielin ustrojowych: śliny światła przewodu pokarmowego (żółć, sok trzustkowy)‏ płynu nasiennego ich pojawienie się w osoczu świadczy o zaburzeniu procesu wydzielania (zastój wydzieliny) i/lub niszczeniu struktury gruczołu przykłady: amylaza lipaza fosfataza zasadowa

ze względu na budowę chemiczna Klasyfikacja enzymów ze względu na budowę chemiczna Enzymy proste zbudowane tylko z aminokwasów grupa czynna – specyficzne zespoły aminokwasów przykłady: proteazy, amylaza, RNaza Enzymy złożone (większość, holoenzym) złożone z części białkowej (apoenzym) i niebiałkowej (kofaktor)‏ cz. niebiałkowa trwale związana z białkową – grupa prostetyczna gr. prostetyczna – integralna część enzymu przykłady: katalaza, peroksydaza, oksydaza cytochromowa cz. niebiałkowa luźno związana z białkową – koenzym obie części dają łatwo się oddzielić żadna z nich nie jest czynna katalitycznie ponowne połączenie przywraca aktywność przykład: dehydrogenazy

Budowa enzymu substrat - H2O2 centrum aktywne substrat centrum aktywne zgrupowanie wlaściwych reszt aa (często z odległych łańcuchów polipeptydowych) o odpowiednim ułożeniu przestrzennym decyduje o właściwościach katalitycznych enzymu determinuje wysoką sprawność katalityczną odpowiada za specyficzność reakcji

centrum aktywne = miejsce wiązania + miejsce katalityczne Budowa enzymu miejsce wiązania substratu miejsce katalityczne (grupa czynna)‏ metalo-β-laktamaza, MβL (model wstęgowy)‏ centrum aktywne = miejsce wiązania + miejsce katalityczne

Specyficzność enzymów Specyficzność substratowa określa, jaki rodzaj substratu ulega przemianie przy udziale danego enzymu zależy od budowy miejsca wiązania Specyficzność działania katalizowanie reakcji tylko jednego typu katalizowanie tylko jednego z wielu możliwych przekształceń danej substancji (cz. białkowa enzymu) zależna od budowy centrum katalitycznego

Model "klucza i zamka" (Emil Fisher, 1894)‏ enzym i jego substrat są do siebie geometrycznie dopasowane w taki sposób, że idealnie pasują do siebie jak klucz i zamek model wyjaśnia specyficzność enzymów nie wyjaśnia, w jaki sposób stabilizowany jest stan przejściowy podczas reakcji enzymatycznej

Model indukowanego dopasowania (Daniel Koshland, 1958) pod wpływem przyłączenia substratu enzym przybiera konformację niezbędną do katalizy (jak rękawiczka zakładana na rękę) powoduje to zbliżenie i ustawienie w odpowiedniej pozycji substratu i grup czynnych enzymu, a także niekiedy wzrost naprężeń w substracie, co ułatwia rozerwanie określonych wiązań (kataliza przez odkształcanie substratu)

Model "trzypunktowego dołączenia" (Alexander G. Ogston, 1948)‏ enzymy reagują z tylko jedną odmianą stereoizomeryczna danego substratu połączenie enzymu z substratem musi zachodzić co najmniej w 3 miejscach nawet symetryczna cząsteczka staję się „asymetryczną” dla centrum aktywnego – możliwe jest tylko jedno „właściwe” położenie substratu STEREOSPECYFICZOŚĆ

Enzymy jako biokatalizatory Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez: dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają specyficzną rolę w katalizie lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji, która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

NO + NO3 2 NO2

Enzymy ustawiają substrat w przestrzeni w sposób najbardziej sprzyjający zajściu reakcji Zapewniają ścisłą orientację przestrzenna reagujących cząsteczek (eliminowana jest przypadkowość sposobu ich zetknięcia)‏ Zwiększają bliskość substratów i ich lokalne stężenie‏.

Enzymy jako biokatalizatory Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez: dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają specyficzną rolę w katalizie lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji, która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

Teoria kinetyczna – teoria zderzeń 1. reakcja może zajść tylko wtedy, gdy reagujące cząsteczki się zderzają 2. dla każdej reakcji istnieje bariera energetyczna, która musi być przekroczona, aby zaszła reakcja 3. reagujące cząsteczki muszą mieć dostateczną ilość energii, aby przekroczyć tę barierę Wszystko, co zwiększa energię lub częstość zderzeń substratów, zwiększa szybkość reakcji.

Teoria kinetyczna – teoria zderzeń Enzymy obniżają energię aktywacji i ułatwiają zajście reakcji. Energia aktywacji – najmniejsza ilość energii, jaką musi mieć cząsteczka, aby zderzenie był skuteczne (na rozluźnienie wiązań, na pokonanie sił odpychania)

Kinetyka reakcji enzymatycznej opisuje mechanizmy wiązania substratów przez enzymy oraz ich przekształcania w produkty kinetyka Michaelisa-Menten - dwuetapowy przebieg reakcji katalizowanej przez enzymy substraty wiążą się odwracalnie z enzymem, tworząc ze stałą szybkości k1, kompleks enzym-substrat (ES)‏ kompleks ES może się rozpaść na dwa różne sposoby. Może dysocjować do E i S ze stałą szybkości k-1 lub może dojść do chemicznej zmiany substratów i uwolnienia produktów ze stałą szybkości k2, przy czym zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat

Model Michaelisa-Menten stałe stęż. enzymu

Model Michaelisa-Menten V max i Km są charakterystyczne da danej reakcji enzymatycznej i danego substratu tej reakcji. Są zależne od: temperatury siły jonowej Nie zależą od stęż substratu. V max – określa zdolność enzym do przekształcania w produkt. W warunkach całkowitego wysycenia substratem nie zależy od szybkości tworzenia i rozpadu ES

Jednostki aktywności enzymatycznej Katal (kat) ilość enzymu katalizująca przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy układ SI; [mol/s] duża jednostka → używane mikro- , nano-, pikokatal Jednostka enzymu, jednostka enzymatyczna, międzynarodowa jednostka standardowa (U, ang. unit) ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu (lub odpowienich grup chemicznych) w czasie 1 minuty w warunkach standardowych (30°C, optymalne pH, maksymalne wysycenie enzymu substratem) 1U = 1/60 μkatala = 16,67 nanokatala

Jednostki aktywności enzymatycznej Aktywność właściwa liczba jednostek enzymu na 1 mg białka określa czystość preparatu enzymatycznego Aktywność molekularna liczba cząsteczek substratu (lub odpowiednich grup chemicznych) przekształconych przez 1 cząsteczkę enzymu w ciągu 1 minuty (przy optymalnym stężeniu substratu) Stężenie aktywności enzymatycznej w roztworze – kat(lub U)/1 ml roztworu

Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych zwiększają energię kinetyczna reagujących cząsteczek obniżają barierę energetyczną zwiększają częstość zderzeń stężenie substratu stężenie produktu stężenie enzymu temperatura pH obecność inhibitorów i aktywatorów

Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej zwiększenie liczby cząstek mających dostateczną energię zwiększenie prawdopodobieństwa zderzeń ogółem, a przez to zderzeń efektywnych wzrost prędkości reakcji mam miejsce do momentu wysycenia wszystkich cząsteczek enzymu model MM – matematyczny opis tego zjawiska

na szybkość reakcji enzymatycznej Wpływ temperaurty na szybkość reakcji enzymatycznej zwiększenie energii kinetyczne reagujących cząsteczek zwiększenie ilości cząsteczek o energii wyższej niż bariera energetyczna zwiększenie częstości zderzeń wzrost możliwości wytwarzania połączeń, które są mało prawdopodobne w normalnych warunkach zbyt wysoka temperatura – denaturacja białka enzymatycznego gorączka, hipotermia – zmiana aktywności enzymów organizmu

na szybkość reakcji enzymatycznej Wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznej optymalne wartości zwykle w przedziale 5,0 – 9,0 zmiana ładunków elektrycznych grup dysocjujących lub zwiększenie/zmniejszenie liczby wiązań jonowych wewnąrz- i międzyłańcuchowych → zmiana układ łańcucha zmiana ładunków elektrycznych w cząsteczkach substratów denaturacja białka enzymatycznego przy dużych i małych wartościach pH kwasica, zasadowica – zmiana aktywności enzymów organizmu

Inhibicja Zjawisko hamowania aktywności enzymów przez różnego rodzaju związki (inhibitory) Mechanizm kontrolny dla procesów fizjologicznych!. Inhibicja odwracalna: cząsteczki inhibitora wiążą się z enzymem za pomącą słabych oddziaływań kompetycyjna niekompetycyjna akompetycyjna mieszana Inhibicja nieodwracalna - cząsteczki inhibitora wiążą się z enzymem trwale (np. kowalencyjnie), co doprowadza do sytuacji zablokowania aktywności danej cząsteczki enzymu na stałe

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)‏

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)‏ inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne cząsteczki enzymu związanie przez enzym cząsteczki inhibitora uniemożliwia związanie substratów (i vice versa) maksymalna szybkość reakcji, Vmax, nie zmienia się V max może być osiągnięta poprzez zwiększenie stężenia substratów, które przezwycięży inhibicję wraz ze wzrostem stężenia inhibitora rośnie wartość Km + Inhib. 1/v0 1/Vmax -1/KM

Inhibicja kompetycyjna (konkurencyjna, współzawodnicząca) inhibitor jest strukturalnie bardzo podobny do prawdziwego substratu dla danego enzymu przykład: metotreksat – inhibitor kompetycyjny reduktazy dihydrofolianu (dihydrofolian → tetrahydrofolian)‏ kwas foliowy (koenzym) metotreksat

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)‏ Glikol etylenowy – składnik płynów niezamarzających do chłodnic silników Etanol inhibitor kompetycyjny dla dehydrogenazy alkoholowej stos. w zatruciach glikolem

Inhibicja niekompetycyjna

Inhibicja niekompetycyjna inhibitor wiąże się do wolnego enzymu, jednak nigdy do jego miejsca aktywnego → brak konkurencji z substratem kompleksy enzym-inhibitor (EI) i enzym-inhibitor-substrat (EIS) są enzymatycznie nieaktywne wiązanie inhibitora całkowicie niezależne od substratu → wartość Km ł pozostaje stała, wartość Vmax maleje + Inhibit. 1/v0 1/Vmax -1/KM 1/[S]

Inhibitory nieodwracalne - „trucizny” enzymów inhibitor wiąże się kowalencyjnie (a więc nieodwracalnie) do łańcuchów białkowych enzymu lub tak silnie, że dysocjacja kompleksu EI jest bardzo powolna→ trwałe unieczynnienie enzymu chemiczna modyfikacja aminokwasów w enzymie nie daje się odwrócić ani przez usuniecie inhibitora ze środowiska, ani przez zwiększenie ilości substratu penicylina - inhibitor enzymów zawierających serynę aspiryna – inhibitor cyklooksygenazy zw. fosforoorganiczne (insektycydy) – inhibitory acetylocholinoesterazy

Kontrola (regulacja) aktywności enzymatycznej Wpływ na ilość: regulacja syntezy enzymów (indukcja lub represja genu kodującego białko enzymu) i degradacji (półokres rozpadu białka t ½)‏ Wpływ na rozmieszczenie przestrzenne: kompartmentacja Wpływ na aktywność katalityczną: przez sprzężenie zwrotne (hamowanie)‏ przez efektory allosteryczne (enzymy allosteryczne - regulatorowe)‏ przez zmianę struktury enzymu odwracalne modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, defosforylacja), aktywacja proteolityczna (proenzymy = zymogeny)‏ kompleksy (układy) wieloenzymowe

Kompartmentacja fizyczne rozdzielenie przeciwstawnych szlaków metabolicznych w obrębie komórki: biosyteza kw. tłuszczowych – cytozol utlenianie kw. tłuszczowych – mitochodrium w organizmie: niektóre szlaki tylko w wyspecjalizowanych typach komórek kompartmentacja chemiczna przeciwstawne szlaki biegną poprzez inne metabolity pośrednie – rozdzielenie molekuł przeznaczonych do szlaku katabolicznego i anabolicznego

Regulacja przez sprzężenie zwrotne produkt hamuje proces enzymatyczny, w którym powstał zwykle dotyczy szlaków syntezy (etapu imitującego)‏ hamowany jest początkowy etap syntezy inhibitor: ostatnia mała cząsteczka przed utworzeniem związku wielkocząsteczkowego Hamowanie przez sprzężenie zwrotne produkt powoduje represję genu kodującego dany enzym nie wpływa na jego aktywność katalityczną, ale na jego ilość przykład: cholesterol i reduktaza HMG-CoA

Efektory allosteryczne zwykle nie podobne od substratów czy koenzymów danego enzymu łączą się z miejscem allosterycznym („inna przestrzeń”) powodują zmiany konformacyjne w białku enzymatycznym (podjednostki z którą się łączą) → zmiana powinowactwa innych podjednostek do substratu w warunkach fizjologicznych większość enzymów allosteryczny nie dają się opisać kinetyką M-M zarówno w obecności efektorów, jak i bez nich

Wykres zależności Vo = f([S]) dla enzymu allosterycznego - krzywa sigmoidalna - właściwości katalityczne enzymu zmieniają się ze wzrostem stężenia substratu.

Efektory allosteryczne inhibitory aktywatory

Efektory allosteryczne + ATP Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATCaza)‏ katalizuje pierwszą reakcje na szlaku syntezy pirymidyn złożona z 5 podjednostek – 3 regulatorowe i 2 katalityczne‏ - CTP no effector

Modyfikacje kowalencyjne odwracalne zmiany struktury cząsteczki enzymu przebiega po zakończeniu translacji modyfikacje kowalencyjne - dodawanie dodatkowych grup funkcyjnych: fosforylacja glikozylacja ADP-rybozylacja metylacja zmiana właściwości funkcjonalnych białek (zmiana konfrmacji, ładunku)‏ zmiana sprawności katalitycznej, powinowactwa do substratu, wewnątrzkomórkowej lokalizacji, regulacji przez ligandy allosteryczne w momencie fizjologicznego zapotrzebowania

Ograniczona proteoliza - proenzymy proenzym (zymogen) nieaktywny prekursor enzymu do uaktywnienia wymaga jedno- lub kilkustopniowej proteolizy – powstanie centrum katalitycznego (odcięcie fragmentu, przecięcie łańcucha polipeptydowego → zmiana konformacji) przykłady: pepsynogen (→ pepsyna)‏ trypsynogen (→ trypsyna)‏ proinsulina (→ insulina)‏ czynniki krzepnięcia i fibrynolizy możliwe szybkie zaktywowanie w momencie zapotrzebowania ochrona tkanek produkujące proenzymy przed samostrawieniem

Enzymy wielofunkcyjne i kompleksy wieloenzymowe Enzym wielofuncyjny jeden łańcuch polipeptydowy posiadający co najmniej dwie różne aktywności katalityczne i dwa miejsca aktywne Przykład: syntaza kw. tłuszczowych – 3 domeny (1- transferaza acetylowa, syntaza ß-ketoacylowa, transferaza malonylowa; 2- reduktaza ketoacylowa, dehydrataza, reduktaza enoilowa, 3- tioesteraza)‏ Kompleks wieloenzymowy układ kilku białek enzymatycznych o różnych aktywnościach katalitycznych połączone niekowalencyjnie Przykład: ukł. oksydazy pirogronianowej

Enzymy wielofunkcyjne i kompleksy wieloenzymowe Intemediaty przenoszone bezpośrednio z jednego miejsca aktywnego na drugie bez rozpraszania składników reakcji (reagujące cząsteczki nie ulegają rozcieńczeniu w cytozolu, nie muszą odnajdywać się w przypadkowym procesie dyfuzji)‏ Oddzielenie intermediatów od innych substancji – ochrona przed reakcjami współzawodniczącymi synataza kw. tłuszczowych u E.coli (α6β6)

Izoenzymy enzymy katalizujące tę samą reakcję, które występują w różnych tkankach/typach komórek, mogą różnić się strukturą cząsteczki produkty różnych, choć blisko spokrewnionych genów różne właściwości fizyczne i chemiczne: punkt izoelektryczny ruchliwość elektroforetyczna powinowactwo do substratów wykrywanie: bad. aktywności po zablokowani za pomocą mAb niepożądanych izoenzymów dotyczy dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fostataz i proteaz. znacznie zwiększa swoistość tkankowa niż ta, którą można przypisać ich aktywności enzymatycznej!

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)‏ cząsteczka zbudowana z 4 podjednostek – tetramer dwie różne podjednostki syntetyzowane w organizmie: M – typu mięśniowego, (ang. muscle); gen LDHA (chr. 11)‏ H – typu sercowego (ang. heart); gen LDHB (chr. 12)‏ geny LDHA i LDHB podlegają różnej ekspresji w różnych tkankach w różnych tkankach różne ilości różnych podjednostek enzymu wytwarzane rożne połączenia podjednostek – 5 izoenzymów: LDH1 – HHHH LDH2 – HHHM LDH3 – HHMM LDH4 – HMMM LDH5 – MMMM

Izoformy enzymów produkty tego samego genu katalizują tę samą reakcję chemiczną inna budowa cząsteczki enzymu na skutek: zmian posttranslacyjnych struktury białka fosfataza alkaliczna (ALP) – izoformy kostna i wątrobowa degradacji proteolitycznej po ich wydzieleniu do pł.śródtkankowego i osocza kinaza kreatynowa – CKMM1, CK-MM2, CK-MM3, CK-MB1, C-MB2 wykrywanie: elektroforeza, oznaczenia immunochemiczne z użyciem przeciwciał moloklonalnych