Drogi podawania biofarmaceutyków białkowych Produkcja sztucznych tkanek z zastosowaniem biopolimerów i systemów kontrolowanego uwalniania substancji

Porównanie cech farmakokinetycznych i farmakodynamicznych leków białkowych i małocząsteczkowych Cecha Leki białkowe Leki małocząsteczkowe Masa cząsteczkowa Sposób podawania Obszar dystrybucji Wiązanie z białkami krwi Obecność w płynach ustrojowych pozakomórkowych Fagocytoza Eliminacja Eliminacja nerkowa Eliminacja wątrobowa Immunogenność >3000 Da Pozajelitowo (dożylnie, podskórnie, domięśniowo, wziewnie Głównie układ krwionośny Nieistotne Zależne od MW i hydrofobowości Istotne dla dużych białek (MW> 300 kDa) i agregatów białkowych Denaturacja, proteoliza Filtracja (MW< 50 kDa), metabolizm Fagocytoza, endocytoza, metabolizm Istotne dla podawanych wielokrotnie <1000 Da Wszystkie drogi Ograniczony hydrofobowością i wiązaniem z białkami ważne Biotransformacja, wiązanie z białkami Filtracja, transport, metabolizm Metabolizm Zwykle nieistotne

Problemy związane z podawaniem białek jako leków stabilność preparatów przez podaniem stabilność podczas przechowywania stosunkowo krótkie czasy półtrwania po podaniu konieczność zabezpieczenia przed proteolizą, eliminacją nerkową i wątrobową sposób podawania immunogenność dotyczy białek innych niż ludzkie; rozwiązanie - koniugaty z polimerem rozpuszczalnym w wodzie

Stabilność preparatów białkowych Czynniki i procesy wpływające na stabilność białek Czynniki fizyczne: temperatura, pH, adsorpcja powierzchniowa, niekowalencyjna agregacja i asocjacja Reakcje chemiczne: utlenianie tryptofanu, metioniny, cysteiny, histydyny, tyrozyny; Hydroliza wiązań peptydowych i amidowych; wymiana mostków disulfidowych Substancje pomocnicze stosowane do stabilizowania białek Substancja pomocnicza Funkcja Cukier (trehaloza, maltoza) Podwyższenie temperatury przejścia międzyfazowego Cukry zredukowane (sorbitol, mannitol) Środki powierzchniowo-czynne Zapobieganie adsorpcji powierzchniowej EDTA Zapobieganie utlenianiu cysteiny Polimery (dekstrany, kaboksymetyloceluloza) Zapobieganie agregacji niekowalencyjnej Aminokwasy (lizyna, arginina) Zwiększenie rozpuszczalności

Sposoby podawania leków białkowych Droga pozajelitowa (93%) Doustnie dożylnie (iv) rzadko stosowane domięśniowo (im) tylko dla preparatów zmodyfikowanych podskórnie (sc) dootrzewnowo wziewnie (aerozole) – 3% Domiejscowo (4%) do oka do serca do rdzenia kręgowego transdermalnie (żele)

Sposoby podawania leków białkowych Podawanie domięśniowe i podskórne Problem konieczności zapewnienia przedłużonego działania Producent Peptyd/białko Wskazanie Postać Alkermes/Genentch Alkermes/ Johnson&Johnson Takeda AstraZeneca Rekombinowany ludzki hormon wzrostu Erytropoetyna Octan leuproreliny Octan gosereliny Zaburzenia wzrostu Niedokrwistość Rak prostaty Mikrocząstki (ProLease) Mikrocząstki (PLA/PGLA) Implanty Polimery biokompatybilne, biodegradowalne, nieimmunogenne PLA – polimleczan PLGA – poli(D,L-mleczan-co-glikolan)

Sposoby podawania leków białkowych Implantowana pompa osmotyczna Przed implantacją system napełnia się roztworem leku. W miejscu implantacji woda przenika przez błonę do komory osmotycznej. Ilość roztworu leku wydzielanego ze zbiornika odpowiada ilości wody wchodzącej do komory Taki system zapewnia stały poziom leku białkowego w osoczu

Sposoby podawania leków białkowych Samoregulujący się system podawania insuliny

Sposoby podawania leków białkowych Podawanie wziewne Forma leku: aerozol Drogi wnikania: nabłonek doprowadzających dróg oddechowych (tchawica, oskrzela, oskrzeliki) – 5% powierzchni nabłonka płuc Komórki nabłonka kolumnowego, warstwa 30 – 40 m, stosunkowo nieprzepuszczalne dla większych cząsteczek (>5 kDa). Możliwy transport na drodze dyfuzji okołokomórkowej, transcytozy lub z udziałem receptorów. Można osiągnąć zwiększenie przenikalności okołokomórkowej podając cytochalazynę lub poli-L-lizynę. nabłonek pęcherzyków płucnych – 95% nabłonka płuc; warstwa o grubości 0.1 – 0.2 m; przepuszczalny dla makrocząsteczek o MW <40 kDa. Powierzchnia adsorpcji około 75 m2. Biodostępność białek – 10 – 20% Podanie tą drogą – ominięcie metabolizmu wątrobowego Preparaty biofarmaceutyków do inhalacji: insulina: DPI (dry powder inhaler) – rozpylenie drobnego proszku do stojącego obłoku aerozolu; system AER – rozpylanie na mgłę roztworu białka przez mikroporowate folie - DNAza (mukowiscydoza), także terapia genowa mukowiscydozy (nośniki liposomowe)

Sposoby podawania leków białkowych Podawanie doustne Białka podawane doustnie - <5% przechodzi do krwiobiegu (także gdy w kapsułkach zabezpieczających przed degradacją w żołądku). Niezmodyfikowane białko terapeutyczne ulega w ciągu max. 10 min degradacji w jelicie cienkim.

modyfikacje chemiczne za pomocą dużych obojętnych ugrupowań Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych modyfikacje chemiczne za pomocą dużych obojętnych ugrupowań połączenie z drugą cząsteczką białka zwiększenie masy cząsteczkowej, - powyżej 50 000 Da, tj. powyżej progu zdolności usuwania cząsteczek przez nerki zapobieganie degradacji cząsteczek przez proteazy

Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych PEGylacja - przyłączanie kowalencyjne glikoli polietylenowych do białek terapeutycznych dłuższy okres wchłaniania, zmniejszenie procesu degradacji przez proteolizę zmniejszenie antygenowości zwiększenie stabilności termicznej i mechanicznej cząsteczki dłuższa eliminacja z organizmu

Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych PEGylacja Przykłady stosowanych leków modyfikowanych: PEGylowana deaminanaza ( Adagen )- w terapii genetycznego niedoboru deaminazy adenozynowej PEGylowana L-asparaginaza (Oncospar), w terapii białaczki limfoblastycznej PEG- Intron (Pegintron- 2001) - w terapii chronicznego zapalenia wątroby typu C Pegasys (2002) - w terapii chronicznego zapalenia wątroby typu C

Białka fuzyjne - zawierają białko terapeutyczne Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych Białka fuzyjne - zawierają białko terapeutyczne i białkowy fragment dodatkowy zwiększenie masy cząsteczkowej leku powyżej progu nerkowego wykorzystanie specyficznych właściwości przeciwciał dla wzmocnienia ukierunkowanego działania leku wyższa aktywność formy dimerycznej w porównaniu z monomeryczną

WSKAZANIE TERAPEUTYCZNE FIRMA, ROK WPROWADZENIA Białka fuzyjne PREPARAT WSKAZANIE TERAPEUTYCZNE FIRMA, ROK WPROWADZENIA Amevive (dimeryczne białko fuzyjne ) umiarkowana- groźna przewlekła łuszczyca Biogen 2003(USA) Enbrel ( dimeryczne białko fuzyjne powstałe z połączenia domeny receptora TNF z rejonem Fc IgG1 ) aktywne reumatoidalne zapalenie stawów u osób dorosłych, choroba Crohna Amgen I Wyeth 1998 (USA) Wyeth Europa Ltd 2000 (EU) Ontak ( białko fuzyjne złożone z rIL-2 i zmodyfikowanej toksyny błoniczej ) skórne chłoniaki z limfocytów T Ligand Pharmaceuticalis 1999 (USA)

Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych Enbrel: białko fuzyjne typu X –Fc TNF (tumor necrosis factor) czynnik martwicy nowotworów aktywne białko procesu zapalnego podstawowa rola w schorzeniach związanych ze stanami zapalnymi i schorzeniami autoimmunologicznymi

Enbrel: białko fuzyjne typu X –Fc powstałe przez połączenie zewnątrz- komórkowej domeny receptora TNF ( sTNF ) z rejonem Fc immunoglobuliny Rys. schemat immunoglobuliny 1-fragment wiążący antygen 2- region Fab 3- region Fc

Strategie redukcji immunogenności biofarmaceutyków białkowych Dla białek ludzkich jak najwyższa czystość preparatu Dla białek obcych zmiany sekwencji aminokwasowych zmiany stopnia glikozylacji tworzenie koniugatów z PEG

Produkcja sztucznych tkanek z zastosowaniem biopolimerów i systemów kontrolowanego uwalniania substancji

Sposób postępowania w inżynierii tkankowej

Warunki efektywnego prowadzenia terapii metodą inżynierii tkankowej znalezienie odpowiedniego materiału na matrycę, zapewniającego dobrą adhezję komórek, ich rozmnażanie się, a następnie różnicowanie możliwość przetworzenia biotworzywa matrycy na porowaty nośnik ustalenie optymalnych warunków hodowli komórkowej – aplikacji czynników wzrostu i innych substancji sprzyjających rozwojowi tkanki opracowanie odpowiednich form aplikacji zapewniających kontrolowane uwalnianie czynników wzrostu zarówno in vitro jak i in vivo

Transplantacja organów,a inżynieria tkankowa Cel (w obydwu przypadkach): rekonstytucja organu utraconego (wypadki, nowotwory, martwica pocukrzycowa, wady wrodzone), lub poważnie uszkodzonego, niezdolnego do pełnienia swojej funkcji • Transplantacja – zabieg chirurgiczny wszczepienia organu pobranego od dawcy • Inżynieria tkankowa – działania zmierzające do regeneracji własnych tkanek lub narządów (także transplantacja komórek)

Źródła komórek: • Autologiczne (własne); zwykle niedostateczna ilość, można namnażać w hodowli; niebezpieczeństwo infekcji • Allogeniczne (od innego osobnika); immunogenne • Ksenogeniczne (pochodzenie zwierzęce, n.p. świńskie); immunogene, niebezpieczeństwo zakażenia retrowirusami

Komórki można podzielić pod względem stopnia zróżnicowania (komórki macierzyste, stem cells) Wielopotencjalne (Pluripotencjalne) : EC (embrionic stem cells), EG (embrionic germ cells) Wielopotencjalne ukierunkowane: MSC (mesenchymal stem cells), HSC (hematopoietic stem cells), Komórki progenitorowe w dojrzałych tkankach: keratynocyty, hepatocyty, osteoblasty Komórki szpiku kostnego mogą różnicować się we wszystkie typy komórek, zależnie w jakie miejsce zostaną wszczepione („universal stem cells”). Niewykluczone, że transdyferencjacja jest wynikiem fuzji komórek somatycznych gospodarza i komórek macierzystych.

Regeneracja tkanek wymaga: • 1. Odpowiednich komórek • 2. Macierzy (szkieletu, matrycy)- scaffold • 3. Czynników wzrostowych (growth facttors) Nie zawsze są wymagane wszystkie trzy elementy: - może wystarczyć sama warstwa porowatego kolagenu (np. regeneracja skóry; komórki migrują ze zdrowych tkanek - fibroblasty, które produkują białka i glikozaminoglikany tworząc tkankę skórną, scaffold ulega absorpcji) - lub same komórki (terapia komórkowa, cell therapy). Pierwsze rekonstrukcje skóry z użyciem matrycy i komórek keratynocytów oraz fibroblastów zaczęto przeprowadzać w roku 1980.

Funkcja matrycy (scaffold) podobna do funkcji naturalnej ECM: • Podporowa - stanowi rusztowanie dla komórek • Stymuluje proliferację • Stymuluje różnicowanie • Stymuluje biosyntezę w komórce • Chroni uszkodzone miejsce przed infekcją i dalszymi uszkodzeniami

Pożądane cechy matrycy : • Obecność połączonych mikroporów (100-500 µm) poziomych i pionowych; rozprzestrzenianie podczas siania, migracja wewnątrz porów, przenikanie składników medium • Zastosowana na ranę powinna pozwalać na formowanie naczyń i migrację do jej wnętrza komórek i odprowadzanie produktów przemiany materii • Odpowiednia wytrzymałość mechaniczna przy dużej powierzchni porów (możliwość połączenia szwami z tkanką,odporna na rozciąganie) Biomateriały – szkielety polimerowe do adhezji, namanażania i różnicowania komórek (biodegradowalne polimery) Polimery naturalne: Kollagen, żelatyna, kwas hialuronowy, chityna Polimery syntetyczne: Organiczne: głównie poli--hydroksyestry, w tym: PGA (kwas poliglikolowy), PLA (kwas polimlekowy), kopolimer PLGA (kopolimer kwasu glikolowego i mlekowego) oraz PVA (polimer alkoholu winylowego) Nieorganiczne: hydroksyapatyt, fosforan wapnia Wspólną cechą jest porowatość umożliwiająca osiedlenie się znacznej ilości komórek (porowata gąbka)

Zdjęcia matryc polimerowych wykonane z zastosowaniem elektronowej mikroskopii skanningowej Po lewej – matryca wykonana z PLGA, po prawej – matryca z PGA

Matryce ulegają zróżnicowanej degradacji i absorpcji w tkankach • Naturalne biopolimery (kolagen, kwas hialuronowy, chityna) są rozkładane są na drodze hydrolizy enzymatycznej. z wyjątkiem chityny są to związki hydrofilowe – niska wytrzymałość mechaniczna w porównaniu do poli--hydroksykwasów • Poli-  -hydroksykwasy rozkładane są w procesie hydrolizy nieenzymatycznej • PVA- nie degraduje się

Szybkość rozkładu i absorpcji materiałów matrycowych Czas degradacji powinien odpowiadać potrzebom danej tkanki: Regeneracja elementów układu kostnego – czas bardzo długi (lata) Regeneracja skóry – czas musi być krótki (do 1 miesiąca). Dłuższe pozostawanie niezdegradowanej matrycy może działać wręcz uszkadzająco zamiast promować regenerację

Wpływ rodzaju adhezji komórek do matrycy na funkcję komórek

Inżynieria tkankowa ex vivo z wykorzystaniem komórek autologicznych

Porównanie warunków inżynierii tkankowej ex vivo i in vivo (in situ)

Czynniki wzrostowe – niezbędne elementy inżynierii tkankowej W warunkach in vivo czynniki wzrostowe (growth factors) wydzielane są przez komórki na własne potrzeby (sekrecja autokrynna), lub w odpowiedzi na sygnały nadchodzące od innych komórek (sekrecja parakrynna) • W procesie regeneracji tkanek czynniki wzrostowe są wydzielane przez komórki użyte do inżynierii tkankowej; • Nawet allogeniczna tkanka skórna uzyskana tą drogą wydziela czynniki wzrostowe do miejsca uszkodzonej tkanki, w której została ulokowana Najczęściej używane czynniki wzrostowe: • Bone morphogenetic proteins (BMPs), białka morfogenetycznekości (rodzina transformujących czynników wzrostu typu ) • Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, FGF-2) • Naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu, VEGF • Transformujący czynnik wzrostu nowotworów, TGF  • Czynnik wzrostu hepatocytów • BMP i bFGF są w stanie same stymulować regenerację kości i naczyń (czynniki różnicujące)

Różne możliwości kontrolowanego uwolnienia czynników wzrostu do rozwijających się tkanek Po lewej – uwolnienie z matrycy polimerowej Po prawej – uwolnienie z implantu i mikrocząstki

Sposoby dostarczania czynników wzrostowych do regenerowanej tkanki: • Bezpośrednie wstrzykiwanie DNA plazmidowego, które zawiera gen kodujący czynnik wzrostu • Transfekcja genu danego czynnika wzrostu do komórek, które będą przeszczepiane i transplantacja tych komórek do tkanki, która ma być regenerowana • Bezpośrednie związanie czynników wzrostowych z matrycą (GF związany najpierw z odpowiednim nośnikiem)

Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej Możliwości regeneracji tkanek: kości (komórki szpiku: komórki podścieliska + komórki układu hematopoetycznego) chrząstki (chondrocyty + osteoblasty) wątroba (hepatocycty + fibroblasty) skóra (keratynocyty + fibroblasty) komórki mięśnia sercowego (kardiomiocyty + fibroblasty)

Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej Schemat regeneracji kości (Ikada, 2006)

Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej Regeneracja skóry

Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej Regeneracja skóry Do produkcji ekwiwalentów skóry, matryca żelatynowa łączona bywa z chitozanem* i z kwasem hialuronowym (HA). Kwas hialuronowy poprawia wchłanialność wody, elastyczność i biokompatybilność. Na takiej matrycy inkubuje się keratynocyty i fibroblasty. Po 2 tygodniach można zaobserwować tworzące się warstwy nabłonka walcowatego i płaskiego, a badania immunohistochemiczne wykazują obecność lamininy i kolagenu (składników błony podstawnej). Chitozan*- otrzymywany z chityny izolowanej z pancerzy morskich skorupiaków. Wiążąc wiele cząsteczek wody, tworzy trwały żel absorbujący cząsteczki tłuszczów, węglowodanów, białek, cholesterolu, czynników wzrostowych Fragmenty skóry można też hodować na warstwie tkaniny bawełnianej lub nylonowej i na macierzy z poliuretanu

Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej Hodowla hepatocytów (komórek wątroby) • Cel: transplantacja komórek wątrobowych (próby kliniczne w terapii genowej - transfer genów) • Cele badawcze • Hepatocyty b. trudno hodują się in vitro w zwykłych warunkach. Rosną lepiej na matrycy biopolimerowej (polimer kwasu glikolowego, PGA, lub kwasu mlekowego, PLLA) • Czynniki wzrostowe HGF (hepatocyte growth factor) • Wspólna hodowla z innymi komórkami (komórki nabłonka przewodów żółciowych, komórki wysepkowe trzustki) • Dodatek innych czynników: DMSO, nikotynamid • Namnożone hepatocyty wykorzystywać można do przeszczepów w leczeniu chorób metabolicznych, marskości wątroby i in. • Świetnie też nadają się do badań biologicznych, np. metabolizmu kwasów tłuszczowych, transportu aminokwasów, wiązania ligandów z receptorami, itp.