CHROMATOGRAFIA Pojęcia podstawowe Parametry chromatograficzne Podstawowe mechanizmy retencji Klasyfikacja metod chromatograficznych

Charakterystyka chromatografii - Chromatografia jest techniką, w której składniki mieszaniny są rozdzielane na podstawie różnicy szybkości, z jaką są przenoszone, w gazowej lub ciekłej fazie ruchomej, przez fazę stacjonarną. - Rozdział ilościowy, pomiędzy fazy, odbywa się na bazie oddziaływań fizykochemicznych. - Analit migruje, w postaci rozpuszczonej, w fazie ruchomej, przez fazę stacjonarną. W tym czasie wielokrotnie ulega sorpcji i desorpcji. - Szybkość migracji określona jest powinowactwem analitu do każdej z faz. - Każdą substancję charakteryzują określone parametry retencji (zatrzymania).

Faza stacjonarna (nieruchoma) Faza stacjonarna jest unieruchomiona w odpowiednim miejscu wewnątrz kolumny lub na płaskiej powierzchni – format metody. Faza stacjonarna ma charakter i spełnia rolę sorbentu – na zasadzie zatrzymywania substancji rozdzielanej na powierzchni (adsorpcja) lub w masie (absorpcja). Fazę stacjonarną stanowić mogą: bibuła; porowate ciała stałe o dużej powierzchni adsorpcji; ciecze trudno lotne; substancje o charakterze żelowym.

Nośnik Faza stacjonarna o zdolnościach sorpcyjnych, rozmieszczona jest na powierzchni nośnika W chromatografii cienkowarstwowej nośnikiem są: płyty szklane; płyty aluminiowe; płyty plastikowe. W chromatografii gazowej: powierzchnia wewnętrzna kolumny drobnoziarniste ciało stałe. W przypadku chromatografii kolumnowej nośnik nie występuje lub jest nim pozbawione zdolności sorpcyjnych wypełnienie drobnoziarniste.

Faza ruchoma (eluent) Faza ruchoma przemieszcza się nad lub przez fazę stacjonarną, wraz z mieszaniną analitów, przenosząc składniki z różną prędkością w ustalonym kierunku. Faza ruchoma może być: cieczą – w chromatografii cieczowej (LC – liquid chromatography) – występuje najczęściej, zarówno w technikach planarnych jak i kolumnowych. gazem – w chromatografii gazowej (GC – gas chromatography) płynem w stanie nadkrytycznym – w chromatografii fluidalnej (SFC – supercritical fluid chromatography).

Fazy: ruchoma i stacjonarna różnią się pomiędzy sobą pod względem właściwości fizykochemicznych.

Współczynnik retencji (k) Efekt zróżnicowania czasu migracji analitu w chromatografii związany jest ze stosunkiem jego powinowactwa fizykochemicznego do fazy nieruchomej i ruchomej. Jeżeli substancja wykazuje duży stopień powinowactwa do rozpuszczalnika – porusza się szybko, jeżeli zaś do fazy stacjonarnej – wolno. Substancja spędza więcej czasu w tej fazie, z którą pozostaje w większym kontakcie. Stężenie analitu w danej fazie zależy od tego powinowactwa.

zawartość substancji w fazie nieruchomej Proces rozdziału analitu pomiędzy dwie fazy – wyznaczenie współczynnika retencji (k) Współczynnik retencji zależy od struktury molekularnej substancji chromatografowanej. Związany jest on ze wszystkimi rodzajami chromatografii zawartość substancji w fazie nieruchomej k = zawartość substancji w fazie ruchomej Wartość tego parametru wpływa zawsze odwrotnie proporcjonalnie na szybkość poruszania się substancji w środowisku analizy.

Współczynnik migracji określa ułamek czasu spędzonego przez substancję w fazie ruchomej – stosowany w chromatografii planarnej faktor retencji połączenie współczynnika retencji k z faktorem Inne nazwy stosowane dla współczynnika migracji to: faktor retencji; ułamek prędkości; współczynnik zatrzymania lub spowolnienia; rate fraction.

Czas retencji i objętość retencji w chromatografii kolumnowej - czas wypływu substancji nie zatrzymywanej na kolumnie k=0; lub czas potrzebny na wypływ całej objętości kolumny eluentu - współczynnik retencji - czas spędzony w fazie ruchomej - prędkość objętościowa fazy ruchomej

Liczba półek teoretycznych – liczba podziałów jednostkowych (N) Długi czas retencji sprzyja rozmyciu piku. Bezpośrednio, wpływa na to zjawisko liczba równowag sorpcji-desorpcji wzdłuż kolumny. Zdolność do tworzenia wąskich, wycinanych frakcji mieszaniny w określonych warunkach i czasie – liczba półek teoretycznych (N) Szerokość piku (w) bezpośrednio opisuje sprawność kolumny zależną od wysokości półki teoretycznej (H)

Rozdzielczość – współczynnik rozdzielenia Rozdzielenie zależy od odległości pików. Współczynnik rozdzielenia zależy od sprawności i selektywności kolumny oraz od retencji substancji (ułamek zawartości w fazie nieruchomej). wzór Purnella - współczynnik selektywności wpływa na oddalenie pików - retencja – ułamek zawartości w fazie nieruchomej Sprawność kolumny – liczba półek teoretycznych N wpływa na szerokość pików w

Wpływ sprawności i selektywności układu na stopień rozdzielenia

Podstawowe mechanizmy retencji Warunkiem uzyskania rozdziału jest zróżnicowanie warunków środowiska fazy stacjonarnej i fazy ruchomej. Różnica powinowactwa substancji rozdzielanej do tych faz lub możliwość tworzenia oddziaływań fizykochemicznych substancji z fazą stacjonarną powoduje możliwość uzyskania efektu retencji. Mechanizm retencji Mechanizm sorpcji podziałowy absorpcja adsorpcyjny adsorpcja jonowymienny wymiana jonowa żelowo-permeacyjny wykluczenie Sorpcja jest procesem, podczas którego cząstki substancji przemieszczają się z fazy ruchomej do fazy stacjonarnej. Desorpcja jest procesem odwrotnym. Procesy te zachodzą w sposób ciągły podczas rozdzielania chromatograficznego. Układ znajduje się w stanie równowagi dynamicznej. W czasie przesuwania się fazy ruchomej substancja ulega wielokrotnie podziałowi między obie fazy

Podziałowy (absorpcyjny) mechanizm retencji Podział jest procesem podobnym do ekstrakcji rozpuszczalnikowej. Faza ciekła pokrywa nośnik lub podłoże pierwotne (drobnoziarniste) w postaci naniesionej lub związanej chemicznie. Gdy ciecz jest związana występuje mechanizm zmodyfikowanego podziału. Substancje rozdzielane dzielą się zgodnie z ich rozpuszczalnością (powinowactwem) w fazie stacjonarnej i ruchomej. Fazą stacjonarną w mechanizmie podziałowym jest ciecz trudno lotna, żel lub inna substancja pęczniejąca. Czysty mechanizm podziałowy występuje w chromatografii gaz-ciecz

Adsorpcyjny mechanizm retencji Adsorpcja jest efektem powierzchniowym. W normalnym układzie faz (NP) wynika z oddziaływań elektrostatycznych (wiązania wodorowe, oddz. dipol-dipol, dipol-dipol indukowany) pomiędzy substancją i miejscami polarnymi (polarne grupy funkcyjne np. OH, Si-O-Si lub Si-OH) fazy stacjonarnej. Faza stacjonarna jest polarna. W odwróconym układzie faz (RP) włókna łańcuchów węglowodoro-wych pokrywające fazę stacjonarną (długość łańcuchów węglowodorowych od C2 do C18) zatrzymują mechanicznie cząstki lub cząsteczki substancji (oddziaływania hydrofobowe)

Jonowymienny mechanizm retencji Wymiana jonowa jest procesem, w którym jony substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej mogą ulegać wymianie na mobilne przeciwjony obdarzone takim samym ładunkiem i związane z przeciwnie naładowanymi, nieruchomymi grupami, chemicznie związanymi z fazą stacjonarną. Faza stacjonarna jest polimerowym przepuszczalnym ciałem stałym (nierozpuszczalna żywica, chemicznie zmodyfikowana krzemionka). Efekt retencji zależy od stałych jonizacji substancji rozdzielanej.

Żelowo-permeacyjny mechanizm retencji Wykluczenie jest procesem, w którym cząstki substancji rozdzielanej, o rozmiarach większych od średnicy największych porów fazy stacjonarnej, pozostają wyłącznie w fazie ruchomej (k = 0). Cząstki substancji, o rozmiarach mniejszych od średnicy najmniejszych porów, dyfundują wszędzie w obrębie struktury fazy stacjonarnej i migrują najwolniej. Fazę stacjonarną stanowią: polisacharydy – żele pęczniejące w wodzie lub polimery niepolarne – do rozpuszczalników organicznych. Efekt rozdzielenia zależy od wielkości cząstek substancji.

KLASYFIKACJA METOD CHROMATOGRAFICZNYCH Rodzaj metody Format Technika Chromatografia cieczowa (LC) Chromatografia bibułowa (PC) planarna podział (adsorpcja, wymiana jonowa, wykluczenie) Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) planarna adsorpcja (podział, Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) kolumnowa adsorpcja (podział, Chromatografia nadkrytyczna (SFC) podział Chromatografia gazowa (GC) Chromatografia gaz-ciecz (GLC) kolumnowa podział Chromatografia gaz-ciało stałe (GSC) kolumnowa adsorpcja