Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 PODSTAWOWE INFORMACJE Z ZAKRESU BIOFILMU dr inż. Joanna Biernasiak dr inż. Ilona Błaszczyk

Leeuwenhoek A.V. (1684). Some microscopical observations about animals in the scurf of the teeth. Phil Trans, 14, W publikacji przedstawiono pierwsze wyniki badań, świadczące iż mikroorganizmy mogą adherować do powierzchni zębów i formować osiadłe struktury. 2 Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Angst E.C. (1923). The fouling of ships bottoms by bacteria. Report, bureau construction and repair. Washington, DC: United State Navy Department W publikacji podkreślono, iż bakterie morskie wykazują większą tendencję do przylegania do kadłubów statków, niż do występowania w wodzie w formie planktonicznej.

Kunicki – Goldfinger W.J.H Życie bakterii. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa Ziemińska S Mikrobiologia wody i ścieków. [W] Dobrzański W.T. (red.): Zarys mikrobiologii dla farmaceutów. Wydanie drugie. Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa W wymienionych pozycjach naukowych zwrócono uwagę, iż w warunkach naturalnych, bakterie nie tworzą kolonii, a rosną często w tzw. zooglejach, czyli skupieniach wydalanego przez siebie śluzu. Szkoła Letnia STC - Łódź 2011

Biofilmy to złożone, wielokomórkowe struktury drobnoustrojów, otoczone warstwą śluzu, wykazujące adhezję do powierzchni biologicznych i abiotycznych. Shi X. & Zhu X. (2009). Biofilm formation and food safety in food industries. Trends in Food Science & Technology, 20,

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Struktura biofilmu: Rysunek 1. Zróżnicowanie aktywności metabolicznej w obrębie biofilmu [

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Etapy tworzenia biofilmu: 1.Adhezja odwracalna pojedynczych komórek do powierzchni; 2.Adhezja nieodwracalna komórek; 3.Tworzenie mikrokolonii; 4.Różnicowanie się osiadłej populacji bakterii i utworzenie dojrzałej formy biofilmu; 5.Migracja komórek.

Szkoła Letnia STC - Łódź Adhezja odwracalna Fizyczne oddziaływania, tj. siły hydro i termodynamiczne, dyfuzja, grawitacja, siły Van der Waalsa, elektrostatyczny ładunek powierzchni, ruchliwość samych komórek Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [ edu/davies/research.htm]

Szkoła Letnia STC - Łódź Adhezja nieodwracalna Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [ edu/davies/research.htm] Chemiczne intereakcje, tj. wiązania wodorowe oraz tworzenie par i kompleksów jonowych Synteza i wydzielanie zewnątrzkomórkowych biopolimerów (EPS – extracellular polymeric substances)

Szkoła Letnia STC - Łódź Tworzenie mikrokolonii Indukcja i supresja poszczególnych genów Ekspresja odpowiednich cech genotypowych Wzmożona synteza i wydzielanie EPS Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [ edu/davies/research.htm]

Szkoła Letnia STC - Łódź Dojrzewanie biofilmu Intensywne namnażanie się komórek, Wytwarzanie glikokaliksu, Adsorbcja substancji mineralnych, związków organicznych oraz komórek innych drobnoustrojów do struktury glikokaliksu. Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [ edu/davies/research.htm]

Szkoła Letnia STC - Łódź Migracja komórek Osiągnięcie przez błonę biologiczną, tzw. krytycznej grubości Migracja komórek z peryferycznych części dojrzałego biofilmu do otaczającego środowiska Proces kolonizacji nowych miejsc/płaszczyzn Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [ edu/davies/research.htm]

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Czynniki warunkujące tworzenie biofilmów: 1.Wydzielanie przez drobnoustroje zewnątrzkomórkowych biopolimerów (EPS – extracellular polymeric substances); 2.Hydrofobowość/hydrofilowość płaszczyzn i komórek; 3.Rodzaj i charakter powierzchni; 4.Czynniki środowiskowe; 5.Obecność innych mikroorganizmów.

Szkoła Letnia STC - Łódź Największy wpływ na powstawanie biofilmów mają wydzielane przez komórkę zewnątrzkomórkowe biopolimery (EPS), które obejmują różne klasy makromolekuł, takie jak: białka, polisacharydy, kwasy nukleinowe czy fosfolipidy. 2.Syntezie zewnątrzkomórkowych biopolimerów sprzyja spowolniony wzrost drobnoustrojów, nadmiar substratu z dostępnym źródłem węgla przy jednoczesnym niedoborze azotu, potasu i fosforanów. 3.W procesach adhezji mikroorganizmów do powierzchni abiotycznych największą rolę odgrywają białka i polisacharydy.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 akumulacja na powierzchni komórki w postaci śluzu lub wydzielanie do podłoża wypełnianie pustych przestrzeni między komórkami mikroorganizmów zabezpieczanie komórek przed destrukcyjnym działaniem osmotycznych i oksydatywnych czynników, w tym środków dezynfekcyjnych Polisacharydy: Białka: uwolnienie do roztworu – utworzenie warstwy kondycjonującej wzrost koncentracji białek – I etap adhezji sekrecja białek in situ – nasilenie adhezji i stabilne „zakotwiczenie” komórek do powierzchni docelowej adsorbcja na powierzchni związków toksycznych i zapobieganie ich dyfuzji do cytoplazmy

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Biofilmy – zagrożenie w wielu gałęziach gospodarki 1.Praktyka medyczna Zakażenia u pacjentów adhezja drobnoustrojów do przyrządów i materiałów syntetycznych tj. cewników, drenów, protez stawowych, soczewek kontaktowych i zespoleń naczyniowych Rozprzestrzenianie się chorób zakaźnych adhezja bakterii chorobotwórczych do powierzchni stałych Próchnica i paradontoza adhezja drobnoustrojów do powierzchni zębów

Szkoła Letnia STC - Łódź Przemysł spożywczy Tematyka związana z tworzeniem i skutkami obecności biofilmów została najlepiej udokumentowana w branży mleczarskiej i mięsnej. Pojedyncze komórki Listeria monocytogenes, Bacillus cereus czy Streptococcus thermophilus występują na powierzchniach stykających się z mlekiem surowym czy surowcem mięsnym tys. razy rzadziej niż błony biologiczne tych bakterii Z wyników badań jasno wynika, że biofilm może stanowić realne zagrożenie dla jakości, w tym bezpieczeństwa produktów finalnych, ponieważ błony biologiczne mogą być bezpośrednią przyczyną występowania w żywności toksyn drobnoustrojowych.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Drobnoustroje, które wykazują przyczepność do powierzchni są bardziej oporne na działanie środków dezynfekcyjnych, co ma bardzo istotne znaczenie dla utrzymania higieny i przyczynia się do nieefektywności procesów mycia i dezynfekcji Kinetyka dyfuzji związków przeciwdrobnoustrojowych, o względnej masie cząsteczkowej wynoszącej około 100 kDa, przez warstwy dojrzałego biofilmu może osiągnąć wartość niższą nawet o 60-80% w porównaniu z dyfuzją tych substancji przez agregaty komórek zawieszonych w płynie hodowlanym.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Oporność biofilmu na czynniki antymikrobiologiczne: 1.Wytwarzanie ochronnej warstwy śluzu; 2.Zmniejszenie aktywności metabolicznej; 3.Zmiany zachodzące na poziomie molekularnym; 4.Procesy chemicznego komunikowania; 5.Zespoły związków białkowych.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Gibson i wsp. (1999) badali oporność biofilmu na środki odkażające tj. Easyclean i Ambersan stosowane do higienizacji instalacji przemysłu spożywczego. Wykazano, że testowane środki były nieskuteczne w odniesieniu do biofilmu utworzonego przez Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus. Liczba bakterii na powierzchni ze stali nierdzewnej zmniejszyła się o jeden rząd wielkości. Gibson H., Taylor J.H., Hall K.E.. & Holah J.T. (1999). Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. Journal of Applied Microbiology, 87 (1), 41-48

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 W badaniach prowadzonych przez Wirtanen i wsp. (1996) wykazano, że potraktowanie 3-dniowego biofilmu utworzonego przez bakterie z rodzaju Bacillus przegrzaną parą (125°C, 30 min.) nie wpłynęło na pełną inaktywację komórek. Wirtanen G., Husmark U. & Matilla-Sandholm T. (1996). Microbial evaluation of the biotransfer potential from surfaces with Bacillus biofilms after rinsing and cleaning procedures in closed food-processing system. Journal of Food Protection, 59 (7),

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Biofilmy w przemyśle cukrowniczym: W literaturze światowej brak jest informacji na temat biofilmów w przemyśle cukrowniczym Dane literaturowe dotyczą głównie oceny mikrobiologicznej końcowego produktu oraz oceny higieny środowiska produkcji i pracowników

Szkoła Letnia STC - Łódź Technologiczny proces otrzymywania cukru z buraków cukrowych, można rozpatrywać jako system ekologicznych warunków odpowiednich dla rozwoju licznej mezofilnej i termofilnej mikroflory. 2.Ilość i rodzaj drobnoustrojów towarzyszących temu procesowi jest funkcją jakości mikrobiologicznej surowca oraz warunków fizycznych i chemicznych w środowisku produkcyjnym.

Szkoła Letnia STC - Łódź Ogólna liczba drobnoustrojów zanieczyszczających buraki cukrowe wynosi jtk/g, przy czym dominują bakterie z rodzaju Clostridium, Bacillus, Micrococcus i Flavobacterium. Przy intensywnym nawożeniu naturalnym mikroflorę zanieczyszczającą stanowią również oportunistyczne bakterie pochodzenia jelitowego oraz bakterie chorobotwórcze, np. Listeria monocytogenes i patogenne szczepy Esherichia coli. Kręgiel D., Piątkiewicz A., Żakowska Z., Kunicka-Styczyńska A. (2008). Zanieczyszczenia mikrobiologiczne surowców. W: Mikrobiologia techniczna tom 2. Red. Z. Libudzisz, K. Kowal, Z. Żakowska. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa, s. 235 – 252

Szkoła Letnia STC - Łódź Przy krojeniu buraków następuje przejście mikroorganizmów z powierzchni zewnętrznej na całą powierzchnię krajanki. Liczba drobnoustrojów w 1g krajanki wynosi jtk bakterii mezofilnych i od jtk bakterii termofilnych. 5.Kolejnym etapem otrzymywania cukru z buraka cukrowego jest ekstrakcja krajanki gorącą wodą, w celu otrzymania soku surowego. W czasie przemieszczania mas często powstają w ekstraktorze przestrzenie (biofilmy ???) gdzie zalega krajanka tworząc dogodne warunki dla rozwoju drobnoustrojów mezofilnych. Kowalska M. (2002). System HACCP a zagrożenia mikrobiologiczne w przemyśle cukrowniczym. Gazeta Cukrownicza, 6,

Szkoła Letnia STC - Łódź Temperaturę dyfuzji przeżywają przetrwalniki niektórych bakterii mezofilnych m.in. tlenowe Bacillus megatherium, B. mycoides, B. mesentericus, B. macerans, B. polimyxa, B. cereus, B. subtilis i termofilne Geobacillus stearothermophilus oraz beztlenowe z rodzaju Clostridium. Temperatura panująca w aparacie dyfuzyjnym nie niszczy nieprzetrwalnikujących bakterii z rodzaju Leuconostoc wytwarzających pozakomórkowo dekstrany. Dobrzycki, J. (1988). Colloids and their role in sugar production. In J. Dobrzycki (Eds.), The chemical bases of sugar technology. Warsaw: Technical and Scientific Publisher, pp

Szkoła Letnia STC - Łódź Ze względu na warunki panujące w kolejnych etapach procesu technologicznego, tj. wysoką temperaturę (>75ºC), wysokie pH (>10,0) i dużą zawartość suchej substancji (Bx>70º) cukier opuszczający wirówkę powinien być wolny od komórek wegetatywnych i mogą występować jedynie przetrwalniki bakterii i spory pleśni. W praktyce liczba drobnoustrojów w cukrze rośnie na kolejnych etapach suszenia i pakowania. Dominującą grupę drobnoustrojów w cukrze pobranym do badań w różnych miejscach produktowni (od wirówki cukrzycy I do pakowni) stanowią bakterie mezofilne. Kowalska M. (2002). System HACCP a zagrożenia mikrobiologiczne w przemyśle cukrowniczym. Gazeta Cukrownicza, 6,

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Dotychczas nie opublikowano wyników badań wiążących zanieczyszczenie mikrobiologiczne cukru z biofilmem tworzonym na powierzchniach produkcyjnych. Przesłanką do potwierdzenia tej hipotezy są wyniki przeprowadzonych badań (Żakowska i Kunicka, 2002) wskazujące na powszechność zasiedlania stref martwych wirówek, taśm transporterów cukru suchego czy wago- pakowaczek bakteriami i pleśniami mezofilnymi. Żakowska Z., Kunicka A. (2002). Zagrożenia mikrobiologiczne. Czynniki wpływające na jakość cukru w procesie technologicznym. Nowe Cukrownictwo, 3, 22-24

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Tworzenie biofilmu w procesie produkcji cukru może być również rozpatrywane w aspekcie właściwości fizykochemicznych cukru białego. Jednym z ważnych kryteriów wymaganych przez producentów napojów bezalkoholowych jest zdolność cukru do tworzenia w zakwaszonych roztworach wodnych koloidalnych cząstek widocznych gołym okiem określanych w cukrownictwie jako kłaczki. Foong K.K., Amal R., Doherty W.O.S. & Edye L.A. (2002). A review on acid beverage floc. Zuckerindustrie, 127 (5),

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 W roztworach buraczanego cukru białego z procesem powstawania kłaczków wiąże się obecność saponiny. Saponina stanowi mniej niż 20% ogólnego składu chemicznego kłaczków. Inne substancje takie jak polisacharydy, białka, lipidy, pektyny, barwniki i koloidy obecne w roztworze mogą przyłączać się do wytrąconej saponiny i w ten sposób zwiększać makroskopowy efekt zjawiska. Poel P. W. van der, Schiweck H., Schwartz T. (1998). Sugar Technology. Beet and Cane Sugar Manufacture. Berlin: 16.Verlag Dr. Albert Bartens

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Biorąc pod uwagę doniesienia literaturowe dotyczące składu chemicznego kłaczków, nie można jednoznacznie przyjąć, że źródłem pochodzenia jego składników jest tylko surowiec, tj., buraki cukrowe. Wydaje się uzasadnione podjęcie badań zmierzających do pełnej charakterystyki chemicznej matrycy biofilmu w aspekcie podatności cukru białego na tworzenie widocznych cząstek w roztworach określanych w cukrownictwie jako kłaczki.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ