1 Oznaczanie zawartości dekstranu i skrobi w cukrze Aneta Antczak Dr inż. Maciej Wojtczak Instytut Chemicznej Technologii Żywności Specjalistyczne Laboratorium Analityki Cukrowniczej

2 Dekstran Pojęciem dekstranu określa się wysokocząsteczkowy i w większości prostołańcuchowy polimer glukozy z przeważającą liczbą wiązań α- (1-6) glikozydowych oraz wiązaniami α-(1-2), α-(1-3) i α-(1-4) w łańcuchach bocznych. Głównym źródłem powstawania dekstranu są działające w szerokim zakresie temperaturowym ( C) bakterie Leuconostoc mesenteroides - mezofilne, heterofermentacyjne bakterie mlekowe, wydzielające enzym transferazę- α - D- glukopiranozydową, który przekształca sacharozę we fruktozę i dekstran.

3 Skrobia Pojęciem skrobi określa się wysokocząsteczkowy polisacharyd, składający się z merów glukozy połączonych wiązaniami glikozydowymi, pełniący w roślinach rolę magazynu energii; skrobia (C6H10O5)n, n=300÷360. Skrobia składa się z dwóch różnych polisacharydów: nierozgałęzionej amylozy, stanowi około 20%, dobrze rozpuszczalna w wodzie rozgałęzionej amylopektyny, stanowi około 80%, słabo rozpuszczalna w wodzie

4 Skrobia jest naturalnie występującym składnikiem trzciny cukrowej, stanowiącym główne źródło energii dla rośliny. Formowana jest w trzcinie cukrowej, w wyniku kondensacji glukozy, podczas nieobecności promieni słonecznych, natomiast w ciągu dnia zamieniana jest na sacharozę. Zlokalizowana jest w łodydze trzciny, ale znacznie obfitsze jej stężenia występują w wierzchołku wzrostu i liściach. Skrobia obecna jest nie tylko w samej roślinie, ale również we wszystkich produktach pochodzących z przerobu trzciny cukrowej, otrzymanych zarówno w fabryce jak i rafinerii, zawierających surowy oraz rafinowany cukier. Źródła dekstranu i skrobi W trzcinie cukrowej drobnoustroje infekują uszkodzone komórki trzciny cukrowej. Uszkodzenie komórek rośliny następuje podczas ścinania trzciny, palenia, w wyniku przemarznięcia rośliny oraz w wyniku dotykających roślinę chorób. Poziom dekstranu zależy od dwóch czynników: zagęszczenia populacji mikroorganizmów produkujących dekstran oraz od ich zdolności produkcyjnej.

5 Wpływ zawartości dekstranu i skrobi  Wzrost lepkości soku  Spowolnienie procesu filtracji poprzez zamulanie tkanin filtracyjnych  Spowolnienie procesu krystalizacji cukru  Zmiana kształtu kryształów cukru – iglaste wydłużenie  Zafałszowanie odczytów polaryzacji poprzez zmianę skręcalności soku  Utrudnienie procesu suszenia i kondycjonowania cukru  Wzrost strat cukru do melasu

6 Metody oznaczania dekstranu ICUMSA GS1/2/9-15 (2007) Oznaczanie dekstranu w cukrach zmodyfikowaną metodą mgiełki alkoholowej – oficjalna Oznaczenie zawartości dekstranu w surowym cukrze trzcinowym, trzcinowym cukrze białym i plantacyjnym cukrze białym ICUMSA GS8-19 (2007) Oznaczanie zawartości dekstranu w soku surowym i soku gęstym zmodyfikowaną metodą mgiełki alkoholowej - oficjalna Oznaczenie zawartości dekstranu w soku surowym i soku gęstym z buraka cukrowego Metody te opierają się na pomiarze mgiełki wytworzonej przez polisacharydy, tj. dekstran po dodaniu alkoholu do roztworu cukru za pomocą spektrofotometru przy długości fali 720 nm

7 Pomiar zmętnienia mgiełki dekstranu za pomocą spektrofotometru przy długości fali 720 nm, w odniesieniu do próby ślepej którą stanowi przefiltrowany roztwór cukru rozcieńczony wodą (1:1) Etapy postępowania: Rozpuszczenie próby cukru (syropu) w wodzie Inkubacja próby z zastosowaniem odpowiedniego enzymu (termostabilna α-amylaza), dzięki czemu zniszczeniu ulega rozpuszczalna skrobia Zastosowanie kwasu trichlorooctowego (TCA), w skutek którego wytrąceniu ulega białko, które zostanie odfiltrowane pod próżnią za pomocą ziemi okrzemkowej Mgiełka dekstranu powstaje poprzez dwukrotne rozcieńczenie części przefiltrowanego roztworu poprzez dodanie bezwodnego alkoholu etylowego

8 Przygotowanie krzywej kalibracyjnej: Wzorcowy roztwór dekstranu (T110 lub T500) Wyznaczenie i uwzględnienie wilgotności w przygotowaniu roztworu wzorcowego dekstranu Wzorcowa sacharoza UWAGA Alkohol należy dodać po upływie nie dłuższym niż 20 minut po dodaniu roztworu TCA Absorbancję należy odczytać po upływie 20 minut ±10 sekund Stężenie dekstranu w badanym cukrze należy odczytać bezpośrednio z krzywej kalibracyjnej.

9 Krzywa kalibracyjna Krzywa najlepszego dopasowania Łagodna krzywa przy niskich stężeniach dekstranu, przechodząca w krzywą prawie liniową przy wysokich stężeniach dekstranu

10 Wykres 1. Krzywa kalibracyjna metody ICUMSA GS1/2/9-15

11 Metody oznaczania skrobi Metoda ICUMSA GS1-16 M Metoda ICUMSA GS1-16 Metoda przyjęta przez australijski przemysł cukrowniczy w celu oznaczenia skrobi w surowym cukrze trzcinowym Metoda ICUMSA GS1-17 Szybki test SPRI- metoda tymczasowa, stosowana do różnych produktów i półproduktów, szczególnie używana do trzcinowego cukru surowego Metoda ICUMSA nr 3 (VSI) Oznaczanie skrobi w cukrze surowym oraz w produktach z trzciny cukrowej (syrop trzcinowy, melas) Metoda ICUMSA nr 4 (SMRI) Oznaczenie skrobi w surowym cukrze trzcinowym

12 Metoda ICUMSA GS1-16 Cukier rozpuszczany jest w wodzie. Następnie roztwór jest poddany reakcji z gorącym roztworem chlorku wapnia i kwasu octowego w celu rozpuszczenia skrobi zawartej w cukrze. Następnie do roztworu dodawany jest roztwór jodku potasu z jodanem potasu. Powstaje niebieski kompleksowy związek skrobi z jodem. Absorbancja kompleksu jest odczytywana na spektrofotometrze przy długości fali 700 nm. Przy takiej długości fali, wpływ zanieczyszczeń cukru surowego na odczyt jest minimalny.

13 Metoda ICUMSA GS1-16 Roztwór CaCl 2 o stężeniu 40 % m/m i pH 3,0 ± 0,1 skorygowany mol/l kwasem octowym Kolby z cukrem muszą być umieszczone we wrzącej łaźni w przeciągu 30 minut od momentu dodania wody w celu rozpuszczenia Odczyt wskazań spekrofotometru przy pomiarze absorbancji analizowanego roztworu należy przeprowadzić po upływie od 2 do 5 minut od momentu dodania roztworu jodu potasu z jodanem potasu do analizowanego roztworu Zawartość skrobi w cukrze odczytać bezpośrednio z wykresu kalibracyjnego

14 Krzywa kalibracyjna Standard - rozpuszczalna skrobia ziemniaczana Oznaczenie wilgotności wzorca skrobi i uwzględnienie wilgotności w przygotowaniu roztwory wzorcowego

15 Wykres 2. Krzywe kalibracyjne metody ICUMSA GS1-16 dla trzech różnych wzorców skrobi

16 Metoda ICUMSA GS1-17 (SPRI) Skrobia w cukrze jest rozpuszczana przez gotowanie 15% m/m roztworu cukru w czasie 5 minut. Następnie dodaje się kwas octowy oraz roztwór jodku potasu i jodanu potasu, wydziela się jod, który tworzy niebiesko-purpurowy związek jodu ze skrobią (zabarwienie maskowane przez pomarańczowy kolor wydzielającego się wolnego jodu, w rezultacie próba ma zabarwienie pomarańczowo-brązowe). Absorbancja przereagowanej skrobi jest mierzona przy długości fali 600 nm.

17 Metoda ICUMSA GS1-17 (SPRI) Oznaczenie Brix przygotowanego roztworu Obliczenie zawartości skrobi w cukrze z uwzględnieniem ilości µg skrobi wyliczonej z krzywej kalibracyjnej, rozcieńczenia próbki oraz z uwzględnieniem ilości sacharozy w próbce (odpowiadające zawartości suchej substancji badanego roztworu cukru) Brak ograniczeń czasowych Prostota wykonania

18 Wykres 3. Krzywe kalibracyjne metody ICUMSA GS1-17 (SPRI) dla trzech różnych wzorców skrobi

19 Skrobia w cukrze surowym jest żelowana poprzez gotowanie roztworu przez około jednej minuty. Następnie dodaje się kwasu octowego, jodku potasu i jodanu potasu. Skrobia w środowisku kwaśnym tworzy fioletowo- niebieski kompleks z jodem. Pomiar spektrofotometryczny odbywa się przy długości fali 570 nm. Metoda ICUMSA nr 3 (VSI)

20 Metoda ICUMSA nr 3 (VSI) Obliczenie zawartości skrobi w cukrze z uwzględnieniem absorbancji, współczynnika nachylenia krzywej kalibracyjnej oraz współczynnika rozcieńczenia Brak ograniczeń czasowych Prostota wykonania

21 Wykres 4. Krzywe kalibracyjne metody ICUMSA nr 3 (VSI) dla trzech różnych wzorców skrobi

22 Metoda ICUMSA nr 4 (SMRI) Skrobia jest oddzielana od cukru surowego przez strącenie alkoholem a następnie rozpuszczenie w roztworze chlorku wapnia. Następnie dodaje się kwasu octowego, jodku potasu i jodanu potasu. Kompleks skrobi z jodem jest mierzony przy pomocy spektrofotometru przy długości fali 600 nm.

23 Metoda ICUMSA nr 4 (SMRI) Roztwór CaCl 2 o stężeniu 40 % m/m i pH 3,0 ± 0,1 skorygowany kwasem octowym Alkohol bezwodny Odczyt wskazań spekrofotometru przy pomiarze absorbancji analizowanego roztworu należy przeprowadzić po upływie od 2 do 5 minut od momentu dodania roztworu jodu potasu z jodanem potasu do analizowanego roztworu

24 ICUMSA GS1-17 (SPRI) ICUMSA nr 3 (VSI) ICUMSA GS1-16 ChempurPochSigmaChempurPochSigmaChempurPochSigma Granica wykrywalności LOD mg/kg 20,3315,498,915,42,25127,45,554,22 Granica oznaczalności LOQ mg/kg 40,6730,9717,8210,84,52414,811,098,44 Precyzja: Względne odch. standardowe powtarzalności RSD % 8,487,384, ,99,957,125,37 Względna granica powtarzalności % 4,894,462,343,458,61125,473,922,96 Tab. 1. Wyniki analizy statystycznej skrobi jako wzorca

25 Uzyskane wyniki wykazały istotny wpływ stosowanego wzorca skrobi na uzyskiwane wyniki. PODSUMOWANIE Porównywane metody charakteryzowały się różną precyzją oraz różnymi granicami oznaczalności. Stwierdzono zatem wyraźną potrzebę rekomendowania jednej z tych metod jako metodę referencyjną aby zapewnić porównywalność wyników oznaczania zawartości skrobi w cukrze. Z uwagi na poziom granicy wykrywalności i oznaczalności rekomendować można metodę ICUMSA GS 1-16 Z uwagi na prostotę wykonania i koszt rekomendować można metodę ICUMSA GS 1-17 lub ICUMSA nr 3 (VSI)

26 Metoda enzymatyczna Do oznaczania skrobi rodzimej i częściowo zhydrolizowanej w produktach żywnościowych i innych próbkach Zasada opiera się na tym, iż skrobia w pH 4,6 jest hydrolizowana do D- glukozy przez enzym amyloglukozydazę (AGS) Skrobia + (n-1) H 2 O n(D-glukoza) AGS

27 Metoda enzymatyczna D-glukoza jest fosforylowana do postaci 6-fosforanu D-glukozy (G6-P) przez dehydrogenazę 6-fosforanu D-glukozy (G6P-DH). Reakcję katalizuje heksokinaza (HK) i zachodzi ona z ATP, które przekształca się w ADP na skutek defosforylacji D-glukoza + ATPG-6-P + ADP HK Z kolei w obecności enzymu dehydrogenazy 6-fosforanu glukozy, G- 6-P zostaje utlenione przez fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego do glukonianu 6-fosforowego G-6-P + NADP + glukonian 6-fosforanowy + NADPH + H + G6P-DH Ilość uformowanego w wyniku powyższej reakcji NADPH jest stechiometryczna do ilości D-glukozy. Zmniejszenie się ilości NADPH jest mierzone przy wykorzystaniu jego optycznej absorbancji przy długości fali 334, 340 oraz 364 nm.

28 Dziękuję za uwagę Aneta Antczak