Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) 2 rodzaje cytometrów przepływowych:  analizator 

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) 2 rodzaje cytometrów przepływowych:  analizator "— Zapis prezentacji:

1 Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) 2 rodzaje cytometrów przepływowych:  analizator  sorter Cytometria – metoda pomiaru właściwości fizycznych i chemicznych pojedynczych komórek lub obiektów biologicznych (jądra komórkowe, mitochondria, chloroplasty)

2 Historia: 1934 – publikacja opisująca metodę liczenia komórek przepływających w kapilarze (czujnik fotoelektryczny) 1947 – pierwsze doniesienie o cytofluorymetrycznej detekcji bakterii w aerozolach (badania sponsorowane przez armię USA) urządzenie: detekcja w komorze przepływu w ciemnym polu – oświetlenie światłem widzialnym – detekcja cząstek o średnicy 0.6um 1953 – Wallace Coulter patentuje urządzenie do liczenia krwinek w strumieniu cieczy (wykorzystuje czujnik fotoelektryczny i zasadę ogniskowania hydrodynamicznego)

3 Budowa cytometru

4 Część hydrauliczna  transportuje obiekty w strumieniu cieczy do komory pomiarowej  zapewnia oddzielny przepływ pojedynczych obiektów  ogniskuje przepływające obiekty w środku wiązki lasera

5 Część hydrauliczna (ogniskowanie hydrodynamiczne) płyn osłaniający zawiesina próbki  zawiesina obiektów jest wtłaczana w otoczce płynu osłaniającego do dyszy  płyn osłaniający płynie szybciej od centralnego strumienia próbki  przepływ laminarny centralnego strumienia (o średnicy ok. 30um) umożliwia przepływ pojedynczych obiektów przed optoelektronicznymi układami rejestrującymi

6 Część hydrauliczna  szybkość przepływu 12 – 300 ul/min.  szybkość akwizycji 300 – 50 000 komórek/s  szybkość akwizycji zależy od gęstości obiektów !

7 Układ optyczny

8 Fluorescencja w układzie optycznym Emisja fotonu następuje wtedy, kiedy elektron powraca z wyższej (stan wzbudzenia) orbity na niższą (stan spoczynku)

9 Fluorescencja w układzie optycznym Prawo Stokes’a –długość fali emisyjnego promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większa od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję Przesunięcie Stokes’a - różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji 495 nm 520 nm Stokes Shift is 25 nm Cząsteczka fluoresceiny Intensywność fluorescencji Długość fali

10 http://www.microscopyu.com Rodzaje stosowanych fluorochromów 1.autofluorescencja NADPH, chlorofil, melanina, kolagen, tyrozyna, tryptofan 2.białka wykazujące fluorescencję GFP i jego odmiany: EGFP, ECFP, EYFP DsRed 3. aromatyczne związki organiczne fluoresceina, rodamina, Cy3, DAPI, Alexa Fluor 4. kropki kwantowe

11 Budowa kropek kwantowych 1.rdzeń – selenid kadmu lub telurid kadmu 2.powłoka siarczkowo-cynkowa 3.powłoka polimerowa (umożliwia uzyskanie rozpuszczalności w wodzie, pozwala na koniugowanie nanokryształu z p.ciałem, nukleotydem, streptawidyną; PEG pełni funkcję łącznika) 4.cząsteczka biologiczna Molecular Probes

12 Właściwości kropek kwantowych: 1.rozmiar zbliżony do dużego białka 2.jednakowe spektrum absorpcji 3.rozmiar kryształu determinuje barwę emisji 4.silna fluorescencja 5.‘wypalanie’ barwnika nieznaczne Molecular Probes

13 Układ optyczny najczęściej wykorzystywane lasery: argonowy – niebieski (488nm) diodowy – czerwony (635nm) analiza: zielony, żółty, czerwony, daleki czerwony

14 Układ optyczny rodzaje filtrów górnoprzepustowy dolnoprzepustowy pasmowy

15 Układ optyczny analizowanie obiektów barwionych kilkoma fluorochromami → spektra emisyjne nakładają się kompensacja – proces polegający na eliminacji nakładających się zakresów emisji

16 Układ elektroniczny  przetwarza sygnał analogowy na cyfrowy  pomiar wielkości napięcia  przeprowadza kompensację

17 Wykresy rozproszenia – 2 parametry jednocześnie, każda oś oznacza intensywność, każda kropka – 1 zdarzenie gęstości – kolor oznacza akumulację określonych zdarzeń konturowy – zawiera dodatkową informację (3 wymiar) o ilości zdarzeń posiadających określone parametry x- y dwuwymiarowe

18 histogram – pojedynczy parametr a ilość zdarzeń histogram 3-D – oś Z oznacza ilość zdarzeń

19 Określone populacje (spełniające zadane kryteria) obiektów mogą zostać wyselekcjonowane i oddzielone od innych przez bramkowanie zastosowanie w mieszanych populacjach obiektów do analizy określonych parametrów lub w sortowaniu do uzyskania homogennej populacji

20 Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii detektor przedni FSC (forward scatter) - wielkość detektor boczny SSC (side scatter) - ziarnistość laser Purdue University Cytometry Laboratories

21 Rozproszenie na wprost —Określa wielkość komórki —Mierzone wzdłuż osi padającego lasera na wprost Rozproszenie boczne—światło lasaerowe odbite i rozproszone —Określa gęstość i liczbę ziarnistości (względnie) —Mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni- granulacja komórek i obecność struktur komórkowych Detektor rozproszenia na wprost – informacja o wielkości komórki lub cząsteczki badanej Laser SSC FSC

22 Laser duża ~ wysoki FSC Rozproszenie na wprost (FSC) Laser mała ~ mały FSC Wielkość

23 Zasady analizy FACS – analiza ziarnistości i wielkości 90 Degree Scatter 0 200 400 600 8001000 LIMFOCYTY MONOCYTY NEUTROFILE FSC SSC Purdue University Cytometry Laboratories

24 Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii– analiza fluorescencji laser Fluorescencja detektor przedni detektory fluorescencji (PMT3, PMT4 etc.) Ilość komórek Purdue University Cytometry Laboratories

25 Zasady analizy FACS – analiza fluorescencji zielona fluorescencja żółta fluorescencja Purdue University Cytometry Laboratories

26 Zasady sortowania metodą FACS 1.na zasadzie mechanicznego wychwytu wybranej populacji obiektów przez kapilarę poruszającą się ruchem wahadłowym w strumieniu cieczy (‘catcher- tube sorting’)  słaba wydajność (300 komórek/s)  duże rozcieńczenie sortowanych obiektów

27 Zasady sortowania metodą FACS 2.sortery kroplowe – wykorzystują drgania kryształu piezoelektrycznego powodującego rozerwanie strumienia cieczy w komorze przepływu na pojedyncze krople w zależności od posiadanego ładunku na powierzchni obiekty są odchylane w polu elektrycznym (wytwarzanym przez płytki odchylające) do odpowiednich probówek  możliwość sortowania do 4 różnych populacji jednocześnie  szybkość sortowania do 70 000 komórek/s

28 kryształ piezoelektryczny

29 Wykorzystanie  ocena subpopulacji limfocytów (niedobory immunologiczne, ocena skuteczności immunosupresji)  oznaczanie antygenów HLA (transplantologia)  oznaczanie antygenów HLA B27 (ocena schorzeń autoimmunologicznych)  ocena stopnia degranulacji bazofilów i poziom limfocytów Th1 i Th2 (alergologia)  identyfikacja mutacji chromosomalnych np. chromosom Filadelfia (cytogenetyka)  sortowanie komórek macierzystych (przeszczepy)  sortowanie gamet męskich z chromosomem X i Y (zapłodnienie pozaustrojowe)

30 Zawartość DNA w komórkach w hodowli asynchronicznej barwienie jodkiem propidyny – PI, pozwala ocenić fazy cyklu komórkowego CountCount 0 200 400 600 8001000 G 0 / G 1 S G 2 / M zawartość DNA 2N 4N G2G2G2G2 M G0G0G0G0 G1G1G1G1 S Przykład zastosowania

31 HISTOGRAM DNA G 0 -G 1 S S G 2 -M intensywność fluorescencji PI ilość komórek pik G 0 -G 1 odpowiada ilości DNA = 2n w fazie G 0 i G 1 obszar S to rozkład zawartości DNA w fazie S cyklu komórkowego pik G 2 -M odpowiada ilości DNA = 4n w fazie G 2 i M

32 Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

33 Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

34 Mikroskopia konfokalna Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. http://www.microscopyu.com/tutorials/java/virtual/confocal/index.html

35 Dekonwolucja w mikroskopii http://micro.magnet.fsu.edu/primer/digitalimaging/deconvolution/deconalgorithms.html http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/deconvolution/deconintro.html Zaawansowana technika komputerowej obróbki obrazu mikroskopowego (w formie stosów obrazów – tj. przekrojów w różnych płaszczyznach ostrości) pozwalająca na wyeliminowanie zakłóceń pochodzących z innych płaszczyzn optycznych


Pobierz ppt "Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) 2 rodzaje cytometrów przepływowych:  analizator "

Podobne prezentacje


Reklamy Google