Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) 2 rodzaje cytometrów przepływowych:  analizator 

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) 2 rodzaje cytometrów przepływowych:  analizator "— Zapis prezentacji:

1 Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) 2 rodzaje cytometrów przepływowych:  analizator  sorter Cytometria – metoda pomiaru właściwości fizycznych i chemicznych pojedynczych komórek lub obiektów biologicznych (jądra komórkowe, mitochondria, chloroplasty)

2 Historia: 1934 – publikacja opisująca metodę liczenia komórek przepływających w kapilarze (czujnik fotoelektryczny) 1947 – pierwsze doniesienie o cytofluorymetrycznej detekcji bakterii w aerozolach (badania sponsorowane przez armię USA) urządzenie: detekcja w komorze przepływu w ciemnym polu – oświetlenie światłem widzialnym – detekcja cząstek o średnicy 0.6um 1953 – Wallace Coulter patentuje urządzenie do liczenia krwinek w strumieniu cieczy (wykorzystuje czujnik fotoelektryczny i zasadę ogniskowania hydrodynamicznego)

3 Budowa cytometru

4 Część hydrauliczna  transportuje obiekty w strumieniu cieczy do komory pomiarowej  zapewnia oddzielny przepływ pojedynczych obiektów  ogniskuje przepływające obiekty w środku wiązki lasera

5 Część hydrauliczna (ogniskowanie hydrodynamiczne) płyn osłaniający zawiesina próbki  zawiesina obiektów jest wtłaczana w otoczce płynu osłaniającego do dyszy  płyn osłaniający płynie szybciej od centralnego strumienia próbki  przepływ laminarny centralnego strumienia (o średnicy ok. 30um) umożliwia przepływ pojedynczych obiektów przed optoelektronicznymi układami rejestrującymi

6 Część hydrauliczna  szybkość przepływu 12 – 300 ul/min.  szybkość akwizycji 300 – komórek/s  szybkość akwizycji zależy od gęstości obiektów !

7 Układ optyczny

8 Fluorescencja w układzie optycznym Emisja fotonu następuje wtedy, kiedy elektron powraca z wyższej (stan wzbudzenia) orbity na niższą (stan spoczynku)

9 Fluorescencja w układzie optycznym Prawo Stokes’a –długość fali emisyjnego promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większa od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję Przesunięcie Stokes’a - różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji 495 nm 520 nm Stokes Shift is 25 nm Cząsteczka fluoresceiny Intensywność fluorescencji Długość fali

10 Rodzaje stosowanych fluorochromów 1.autofluorescencja NADPH, chlorofil, melanina, kolagen, tyrozyna, tryptofan 2.białka wykazujące fluorescencję GFP i jego odmiany: EGFP, ECFP, EYFP DsRed 3. aromatyczne związki organiczne fluoresceina, rodamina, Cy3, DAPI, Alexa Fluor 4. kropki kwantowe

11 Budowa kropek kwantowych 1.rdzeń – selenid kadmu lub telurid kadmu 2.powłoka siarczkowo-cynkowa 3.powłoka polimerowa (umożliwia uzyskanie rozpuszczalności w wodzie, pozwala na koniugowanie nanokryształu z p.ciałem, nukleotydem, streptawidyną; PEG pełni funkcję łącznika) 4.cząsteczka biologiczna Molecular Probes

12 Właściwości kropek kwantowych: 1.rozmiar zbliżony do dużego białka 2.jednakowe spektrum absorpcji 3.rozmiar kryształu determinuje barwę emisji 4.silna fluorescencja 5.‘wypalanie’ barwnika nieznaczne Molecular Probes

13 Układ optyczny najczęściej wykorzystywane lasery: argonowy – niebieski (488nm) diodowy – czerwony (635nm) analiza: zielony, żółty, czerwony, daleki czerwony

14 Układ optyczny rodzaje filtrów górnoprzepustowy dolnoprzepustowy pasmowy

15 Układ optyczny analizowanie obiektów barwionych kilkoma fluorochromami → spektra emisyjne nakładają się kompensacja – proces polegający na eliminacji nakładających się zakresów emisji

16 Układ elektroniczny  przetwarza sygnał analogowy na cyfrowy  pomiar wielkości napięcia  przeprowadza kompensację

17 Wykresy rozproszenia – 2 parametry jednocześnie, każda oś oznacza intensywność, każda kropka – 1 zdarzenie gęstości – kolor oznacza akumulację określonych zdarzeń konturowy – zawiera dodatkową informację (3 wymiar) o ilości zdarzeń posiadających określone parametry x- y dwuwymiarowe

18 histogram – pojedynczy parametr a ilość zdarzeń histogram 3-D – oś Z oznacza ilość zdarzeń

19 Określone populacje (spełniające zadane kryteria) obiektów mogą zostać wyselekcjonowane i oddzielone od innych przez bramkowanie zastosowanie w mieszanych populacjach obiektów do analizy określonych parametrów lub w sortowaniu do uzyskania homogennej populacji

20 Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii detektor przedni FSC (forward scatter) - wielkość detektor boczny SSC (side scatter) - ziarnistość laser Purdue University Cytometry Laboratories

21 Rozproszenie na wprost —Określa wielkość komórki —Mierzone wzdłuż osi padającego lasera na wprost Rozproszenie boczne—światło lasaerowe odbite i rozproszone —Określa gęstość i liczbę ziarnistości (względnie) —Mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni- granulacja komórek i obecność struktur komórkowych Detektor rozproszenia na wprost – informacja o wielkości komórki lub cząsteczki badanej Laser SSC FSC

22 Laser duża ~ wysoki FSC Rozproszenie na wprost (FSC) Laser mała ~ mały FSC Wielkość

23 Zasady analizy FACS – analiza ziarnistości i wielkości 90 Degree Scatter LIMFOCYTY MONOCYTY NEUTROFILE FSC SSC Purdue University Cytometry Laboratories

24 Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii– analiza fluorescencji laser Fluorescencja detektor przedni detektory fluorescencji (PMT3, PMT4 etc.) Ilość komórek Purdue University Cytometry Laboratories

25 Zasady analizy FACS – analiza fluorescencji zielona fluorescencja żółta fluorescencja Purdue University Cytometry Laboratories

26 Zasady sortowania metodą FACS 1.na zasadzie mechanicznego wychwytu wybranej populacji obiektów przez kapilarę poruszającą się ruchem wahadłowym w strumieniu cieczy (‘catcher- tube sorting’)  słaba wydajność (300 komórek/s)  duże rozcieńczenie sortowanych obiektów

27 Zasady sortowania metodą FACS 2.sortery kroplowe – wykorzystują drgania kryształu piezoelektrycznego powodującego rozerwanie strumienia cieczy w komorze przepływu na pojedyncze krople w zależności od posiadanego ładunku na powierzchni obiekty są odchylane w polu elektrycznym (wytwarzanym przez płytki odchylające) do odpowiednich probówek  możliwość sortowania do 4 różnych populacji jednocześnie  szybkość sortowania do komórek/s

28 kryształ piezoelektryczny

29 Wykorzystanie  ocena subpopulacji limfocytów (niedobory immunologiczne, ocena skuteczności immunosupresji)  oznaczanie antygenów HLA (transplantologia)  oznaczanie antygenów HLA B27 (ocena schorzeń autoimmunologicznych)  ocena stopnia degranulacji bazofilów i poziom limfocytów Th1 i Th2 (alergologia)  identyfikacja mutacji chromosomalnych np. chromosom Filadelfia (cytogenetyka)  sortowanie komórek macierzystych (przeszczepy)  sortowanie gamet męskich z chromosomem X i Y (zapłodnienie pozaustrojowe)

30 Zawartość DNA w komórkach w hodowli asynchronicznej barwienie jodkiem propidyny – PI, pozwala ocenić fazy cyklu komórkowego CountCount G 0 / G 1 S G 2 / M zawartość DNA 2N 4N G2G2G2G2 M G0G0G0G0 G1G1G1G1 S Przykład zastosowania

31 HISTOGRAM DNA G 0 -G 1 S S G 2 -M intensywność fluorescencji PI ilość komórek pik G 0 -G 1 odpowiada ilości DNA = 2n w fazie G 0 i G 1 obszar S to rozkład zawartości DNA w fazie S cyklu komórkowego pik G 2 -M odpowiada ilości DNA = 4n w fazie G 2 i M

32 Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

33 Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

34 Mikroskopia konfokalna Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science;

35 Dekonwolucja w mikroskopii Zaawansowana technika komputerowej obróbki obrazu mikroskopowego (w formie stosów obrazów – tj. przekrojów w różnych płaszczyznach ostrości) pozwalająca na wyeliminowanie zakłóceń pochodzących z innych płaszczyzn optycznych


Pobierz ppt "Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) 2 rodzaje cytometrów przepływowych:  analizator "

Podobne prezentacje


Reklamy Google