Białka w diagnostyce laboratoryjnej

Prezentacja na temat: "Białka w diagnostyce laboratoryjnej"— Zapis prezentacji:

1 Białka w diagnostyce laboratoryjnej
Stelmach Justyna Gr. A2 III OAM

2 Rola białek osocza: Kontrola dystrybucji płynów przestrzeni pozakomórkowej Funkcje transportowe Regulatory enzymów Białka odpornościowe Ciśnienie onkotyczne Funkcja odżywcza Kontrola dystrybucji płynów przestrzeni pozakomórkowej – głównym białkiem spełniającym te funkcje jest albumina. Funkcje transportowe – niespecyficzny układ o dużej pojemności transportujący hormony,witaminy, wapń, magnez, metale śladowe, bilirubinę, kwasy tłuszczowe, lipidy i leki (albumina); specyficzny transport i regulacja metabolizmu różnych związków (transferyna-Fe, transkobalamina-witamina B12, tyreoglobulina-tyroksyna i trójjodotyronina, haptoglobina-Hb). Regulatory enzymów – inhibitory proteaz (α1-antytrypsyna, α2-makroglobulina); białka układu krzepnięcia; ceruloplazmina katalizuje utlenienie Fe+2 do Fe+3. Białka odpornościowe – immunoglobuliny (odporność swoista); układ dopełniacza (odporność nieswoista).

3 Proteinogram Albuminy 60-70% Alfa-1 globuliny 2-4%
Beta globuliny 8-13% Gamma globuliny 9-22% Całkowite stężenie białka w osoczu g/l Wydalane z moczem= 20-80mg/dobę

4 Za krytyczne uznaje się poziomy białka całkowitego poniżej 45g/l i albuminy poniżej 20g/l.
Przy takich stężeniach ciśnienie onkotyczne jest bardzo niskie, dochodzi do ucieczki wody poza naczynia, powstawania obrzęków i przesięków do jam ciała.

5 Białka specyficzne: Albuminy- ciśnienie onkotyczne (80%)
Alfa1-antytrypsyna-inhibitor proteaz Beta2-mikroglubulina- podjednostka układu HLA Ceruloplazmina- białko wiążące miedź i enzym Białko C-reaktywne (CRP)- wskaźnik stanu zapalnego Transferyna- białko transportujące żelazo Ferrytyna- białko transportujące żelazo w tkankach Haptoglobina- białko wiążące hemoglobinę SHBG-Glubulina wiążąca hormony płciowe- wiąże testosteron TBG-Globulina wiążąca hormony tarczycy Transkobalamina- wiąże wit.B12

6 Paraproteiny immunoglobuliny produkowane przez pojedynczy klon komórek linii limfocytów B (np. plazmocyty) zazwyczaj występuje w obrębie globulin gamma paraproteiny pojawiają się najczęściej w przebiegu szpiczaka mnogiego, plazmocytom i choroby Waldemstrom’a (makroglobulinemia-IgM) elektroforeza białek osocza jest podstawowym badaniem wykrywającym paraproteiny ale mocz powinien być także badany w przebiegu szpiczaka wydzielane są tylko immunoglobuliny zbudowane z łańcuchów lekkich, które są wykrywane w 75% przypadków w moczu jako białko Bence-Jones’a

7 Synteza i degradacja białek osocza:
Dwie duże pule białek: albumina-czynnikiem regulującym jej syntezę w wątrobie jest ciśnienie onkotyczne działające poprzez onkoreceptory łożyska naczyniowego immunoglobuliny-syntetyzowane w limfocytach w wyniku ich aktywacji przez różne antygeny. Degradacja ATP-niezależna w lizosomach (białka nieuszkodzone, „długo żyjące”). Degradacja ATP-zależna w cytosolu (białka nieprawidłowe, „krótko żyjące”). Okres półtrwania białek (czas wymagany do zmniejszenia stężenia białka do 50% wartości początkowej): czynnik VIII krzepnięcia: kilka godzin albumina: czternaście dni immunoglobuliny: dwadzieścia cztery dni Białka osocza nie gromadzą się w wątrobie, prawie cała pula białek znajduje się w przestrzeni międzykomórkowej, tylko 40% jest w naczyniach, pozostałe 60% w przestrzeni pozanaczyniowej. Prawidłowy poziom białka całkowitego zależy od równowagi miedzy syntezą a degradacją dwóch, głównych frakcji białkowych: albuminy i immunoglobulin. Większość białek jest katabolizowana w wątrobie lub komórkach śródbłonka naczyń.

8 Hipoproteinemia: Obniżenie poziomu białek w wyniku:
a) zwiększonej utraty białek b) zahamowania ich syntezy w wątrobie c) rozcieńczenia przez nadmiar lub zmiany dystrybucji wody pozakomórkowej.   Niedobory immunoglobulin Zmiany objętości przestrzeni pozakomórkowej: przewodnienia spadek ciśnienia krwi stany zapalne

9 Zespoły utraty białka:
Przyczyny: Zespoły utraty białka: nerkowe (kłębkowe zapalenie nerek, cukrzyca, toczeń rumieniowaty trzewny, zakrzepica żył nerkowych) jelitowo/żołądkowe (stany zapalne, nowotwory złośliwe, zwężenie, uchyłki, choroba popromienna, niewydolność krążenia, zapalenie krezki) skórne (rozległe oparzenia, dermatozy) wysięki (obrzęki, zapalenia płuc, wodobrzusze) krwotoki stany ciężkie (urazy, nowotwory, sepsa) Zahamowanie syntezy białek w wątrobie: uszkodzenie miąższu wątroby (toksyczne, marskość, zanik miąższu, pierwotny lub wtórny nowotwór) zaburzenia wchłaniania (zespoły poresekcyjne, biegunki bakteryjne, zakażenia, mukowiscydoza) niedobory białka w diecie (niedożywienie)

10 Ocena niedoborów białek osocza
Niskie poziomy białka całkowitego i albuminy mogą poza leczeniem ich przyczyny, wymagać uzupełniania ich niedoboru, a szczególnie gdy są poniżej poziomów krytycznych. Podczas uzupełniania niedoborów należy uwzględnić również wielkość dobową ujemnego bilansu białkowego. Skuteczność tego typu leczenia należy monitorować przez oznaczanie poziomu białka całkowitego i albuminy.

11 Hiperproteinemie Prawdziwa hiperproteinemia jest spowodowana znacznym wzrostem produkcji jednej lub wielu klas immunoglobulin. Zwiększeniu stężenia immunoglobulin często towarzyszy obniżenie poziomu albuminy. Stężenie białka całkowitego może być w granicach normy lub obniżone, nawet przy znacznej hipergammaglobulinemii (w póżnych stadiach marskości wątroby, w rozwoju zespołu nerczycowego w przebiegu chorób kolagenowych). Przyczyny hiperproteinemii Hipergammaglobulinemie: monoklonalne (szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenströma, choroba ciężkich łańcuchów) poliklonalne (przewlekłe stany zapalne, choroby autoimmunologiczne) przewlekłe choroby wątroby (marskość, wirusowe zapalenia, sarkoidoza) odwodnienia

12 Dysproteinemia  to nie prawidłowe proporcje białka we krwi, przy prawidłowym poziomie białka całkowitego

13 Szybkość opadania krwinek czerwonych (Odczyn Biernackiego,OB).
Test oceny zaburzeń proporcji między stężeniami poszczególnych białek osocza i właściwości erytrocytów. W próbie krwi pobranej z antykoagulantem (cytrynian sodu) krwinki czerwone opadają w wyniku większego ciężaru właściwego (1.095g/l) niż osocze (1.027g/l).

14

15 Szybkość OB. Jest wypadkową składu osocza oraz właściwości erytrocytów
Szybkość OB. Jest wypadkową składu osocza oraz właściwości erytrocytów. Zwiększenie stężenia fibrynogenu, białek frakcji globulinowych alfa i beta (białka ostrej fazy), oraz spadek poziomu albuminy powodują wzrost OB. Mała ilość erytrocytów w niedokrwistościach jest przyczyną ich szybszego opadania.

16 Elektroforeza białek surowicy

17 Elekroforeza (bibułowa, na agarozie, na octanie celulozy, w żelu skrobiowym i żelu poliakylamidowym) polega na wędrówce oznaczonych ładunkiem elektrycznym cząstek białkowych w roztworze elektrolitu podczas przepływu stałego prądu elektrycznego szybkość wędrówki zależy od ruchliwości w polu elektrycznym, a ta zależy od wielkości cząstek i wielkości ładunku powierzchniowego Białka, których zmiana stężeń może wpłynąć na obraz elektroforetyczny surowicy to: a) frakcja albuminowa (53-68%) b) frakcja α 1-globulinowa (1-4%) c) frakcja α2- globulinowa (1-14%) d) frakcja β globulinowa (8-17% razem z beta2) e) frakcja gamma-globulinowa (9-22%)

18 Immunoelektroforeza białek surowicy ludzkiej
 to połączenie rozdziału elektroforetycznego i immunoprecypitacji białek, przy zastosowaniu specyficznych reakcji precypitacji antygen-przeciwciało, jest często wykorzystywana w rozpoznawaniu paraproteinemii. Identyfikacja nieprawidłowych białek po rozdziale elektroforetycznym jest możliwa, jeśli zastosuje się surowice odpornościową. W wyniku reakcji antygen (antygenem jest w tym przypadku rozdzielone elektroforetycznie białko) z przeciwciałami znajdującymi się w surowicy odpornościowej wytwarzają się linie precypitacyjne, które umożliwiają identyfikację nieprawidłowego białka. Charakterystyczne zmiany zawartości jednej lub kilku frakcji białkowych stwierdza się w wielu chorobach.

19 CHROMATOGRAFIA  (bibułowa, jonowo wymienna, cienkowarstwowa) wykorzystuje różnice szybkości wędrówki składników białkowych w ośrodkach porowatych.

20 Białka płynu mózgowo-rdzeniowego:
mają skład podobny do białek osoczowych  zaliczamy do nich: prealbuminy, albuminy, α 1- i 2- , β-, gamma- globuliny  stężenie białek w płynie mózgowo-rdzeniowym jest ok. 100 razy mniejsze i wynosi 0,15-0,45 g/l

21 Elektroforeza białek PMR
Cechy charakterystyczne: prealbumina, białko tau (związane z mikrotubulami neuronów, odpowiada za ich stabilizacje oraz wiązanie z neurofilamentami i organellami komórkowymi) Brak fibrynogenu.

22 Albumina Syntetyzowana w wątrobie, ok.15g/dobę.
Czas połowicznego trwania (T1/2) 14 dni. Nieswoisty transporter bilirubiny, hormonów, witamin, wapnia, magnezu, kwasów tłuszczowych, leków oraz substancji wchłoniętych w jelitach i transportowanych do wątroby. Bisalbuminemia – występowanie dwóch rodzajów albumin o różnym składzie aminokwasowym i różnej mobilności elektroforetycznej.

23 Immunoglobuliny: Immunoglobuliny (przeciwciała) mają zdolność swoistego łączenia się z antygenem i są najważniejszymi cząsteczkami układu odpornościowego. Syntetyzowane przez limfocyty B. Na podstawie różnic w budowie łańcuchów ciężkich (α,δ,ε,γ,μ) wyróżniamy odpowiednio pięć klas: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.

24 Hipogammaglobulinemia
Pierwotna – uwarunkowana genetycznie raczej rzadko spotykana, może dotyczyć wszystkich lub jednej klasy Ig. Wtórna – związana z chorobą (nowotwory, leczenie cytostatykami, usunięcie śledziony). Bardzo niskie poziomy immunoglobulin związane są najczęściej z ubytkiem limfocytów B.

25 Hipergammaglobulinemia
Hipergammaglobulinemia poliklonalna – jest to prawidłowa odpowiedź organizmu na infekcję bakteryjną lub wirusową. W pierwszym etapie infekcji następuje wzrost stężenia IgM, po dwóch tygodniach IgG oraz stopniowy zanik IgM. Podwyższony poziom IgA jest często związany z infekcjami błon śluzowych (S-IgA wytwarzane miejscowo przez komórki plazmatyczne błon śluzowych mają zdolność neutralizowania wirusów i wiekszą efektywność aglutynacji bakterii). Hipergammaglobulinemia monoklonalna – wzrost immunoglobulin produkowanych przez nadmiernie rozrastającą się linię limfocytów (grupa chorób nowotworowych limfocytów B). Przyczyny: szpiczaki, makroglobulinemia Waldenströma, chłoniaki i łagodne gammapatie monoklonalne.

26 Białka ostrej fazy Synteza w wątrobie pod wpływem cytokin zapalnych w przebiegu zakażeń bakteryjnych, martwicy tkanek, ostrych i przewlekłych stanów zapalnych, chorób zakaźnych, nowotworów. Część nieswoistej odpowiedzi immunologicznej. Rola- modulowanie odczynu zapalnego i ochrona tkanek nieobjętych stanem zapalnym przed niszczącym działaniem proteinaz i silnych oksydantów wydzielanych przez fagocyty.

27 Niewielki ↑: Choroby nowotworowe Niedożywienie Ciąża Menstruacja
Zespół metaboliczny Opsoniny, inhibitory proteinaz, chelatory metali, transportery hormonów, białka wiążące hem i hemoglobinę, białka układu krzepnięcia (fibrynogen i antyplazmina III) oraz białka układu dopełniacza.

28 Ujemne białka ostrej fazy:
Albumina Transferryna Prealbumina Dodatnie białka ostrej fazy: fibrynogen α1- antytrypsyna (AAT) ceruloplazmina haptoglobina (HP) białko C-reaktywne (CRP) surowicze amyloidowe białko A (SAA) laktoferryna białka układu dopełniacza

29 Białko C-reaktywne Znaczny wzrost obserwowany jest w pierwszej dobie uszkodzenia tkanek (zawał mięśnia sercowego, białaczek, w odrzucie przeszczepów, zakażeniach bakteryjnych). Prawidłowe stężenie CRP w surowicy jest mniejsze niż 5 mg/l. hsCRP - test o wysokiej czułości: 0.2 mg/l; pozwala na zmierzenie bardzo małych wartości CRP z dużą precyzją w zakresie decyzyjnym. Wyniki ostatnich badań wskazują, że stężenie CRP posiada znaczenie prognostyczne w chorobie sercowo-naczyniowej. Procesy zapalne odgrywają bardzo ważną rolę w patogenezie miażdżycy, a stopień podwyższenia poziomu CRP, który jest charakterystyczny dla przewlekłego stanu zapalnego, jest czynnikiem oceniającym ryzyko wystąpienia zawału mięśnia sercowego lub udaru mózgu. Poziom CRP powyżej 2.1 mg/l jest związany z trzykrotnym zwiększeniem ryzyka wystąpienia zawału mięśnia sercowego oraz dwukrotnym zwiększeniem ryzyka wystąpienia udaru mózgu.

30 Metody ilościowego oznaczania białek:
Metoda Lowry’ego Metoda Bradforda Metoda mikrobiuretowa Metoda pomiaru absorbancji w UV Metoda z kwasem Bis-cynchoninowym (BCA) Metoda Kiejdahla Metoda biuretowa Metoda kolorymetryczna z odczynnikiem Nesslera

31 Metoda Kiejdahla Metoda referencyjna, oznaczanie azotu, Zasada:
Zawartość azotu w różnych białkach jest względnie stała i wynosi ok. 16%. Znając odsetek azotu w badanej próbie, można obliczyć, ile zawiera białka.

32 Metoda kolorymetryczna z odczynnikiem Nesslera
Żółtozielony roztwór jodku rtęciowo-potasowego przechodzi w czerwony jodek amidooksyrtęciowy. Pomiar absorbancji nm Zalety: duża specyficzność da wszystkich białek Wady: duża pracochłonność

33 Metoda biuretowa Zasada oznaczenia:
Oznaczanie natężenia barwy powstałej w wyniku utworzenia związków kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym λ =530 nm Zalety:Wysoka specyficzność dla wszystkich białek Wady: niska czułość (10mg/l). Materiał: Surowica, mocz (w zaawansowanej nerczycy)

34 Metoda mikrobiuretowa:
Modyfikacja metody biuretowej Mechanizm podobny, ale zastosowana długość fali 310 nm zwiększa ok 10 x jej czułość Każdą próbę wykonuje się w dwóch szeregach: biały (B) i niebieski (N) Szereg biały zawiera roztwór białka + 30% NaOH, szereg niebieski roztwór białka + CuSO4 w 30% NaOH Właściwą absorbancję do obliczeń otrzymuje się z różnicy N-B. Zalety: wysoka specyficzność w stosunku do wszystkich białek. Wady: duże zużycie roztworu białka (dwa szeregi)

35 Metoda Lowry’ego Zasada: dwie odrębne reakcje: reakcja aminokwasów z odczynnikiem Folina reakcja biuretowa. Zalety:bardzo wysoka czułość reakcji (1mg/l) Wady: mała specyficzność. Materiał : Mocz, PMR.

36 Metoda Bradforda W metodzie wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika błękitu brylantowego - Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G250) z grupami aminowymi białek. λ=595 nm Zalety: prostota i szybkość oznaczenia duża czułość (0,5mg/l) oznaczenia można wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, EDTA, związków tiolowych, sacharozy, glicerolu

37 Metoda pomiaru absorbancji w UV
Wartość wsp. absorpcji zależy od % zawartości aminokwasów aromatycznych i dla białek osocza o stężeniu 1 mg/ml wynosi od 0,8 do 1,6 Obecność kwasów nukleinowych w badanym materiale przeszkadza w oznaczeniu (max absorbcji 260 nm) Wady: Mała specyficzność Metoda nadaje się do oznaczania stężenia oczyszczonego białka (na podstawie znanego wsp. absorpcji)

38 Metoda z kwasem bis-cynchoninowym (BCA)
W alkalicznym środowisku niektóre składniki białek (tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna) redukują jony Cu2+ do Cu1+ Cu1+ tworzą barwny kompleksowy związek z kwasem biscynchoninowym(BCA) λ=540 –580 nm

39 Białka markery

40 Markery zawału mięśnia secowego
Markery prognostyczne: Hs-CRP- high sensitive-C-Reactive Protein (wysoko czułe białko C-reaktywne) MPO- mieloperoksydaza CD-40 Markery destabilizacji blaszki miażdżycowej PAPP-A- Pregnancy-Associated Protein-A (ciążowe białko osoczowe A) Markery niedokrwienia IMA (ACB)- Ischemia Modifed Albumin (Albumin Cobalt Binding) Albumina modyfikowana niedokrwieniem (wiązanie kobaltu przez albuminę)

41 Markery martwicy komórkowej Mioglobina (niespecyficzny) H-FABP- Hart-Fatty Acid Binding Protein (sercowe białko wiążące kwasy tłuszczowe) CK-MB Troponiny sercowe (cardiac)- cTnT, cTnI Marker niewydolności serca Peptydy natriuretyczne (Natriuretic peptides)- ANP-przedsionkowy (atrial) (typ A); BNP- mózgowy (brain) (typ B); NT-proBNP

42 Markery filtracji kłębkowej (nerkowej):
Beta-2 mikroglobulina- jest niskocząsteczkowym białkiem (11.8kDa) obecnym na błonie komórkowej prawie wszystkich komórek jądrzastych (także limfocytów). Beta-2-M jest małą podjednostką antygenu zgodności tkankowej (HLA). Nerka jest głównym miejscem eliminacji beta-2-M gdzie jest filtrowana w kłębuszkach i w 99.9% reabsorbowana w kanalikach proksymalnych. cystatyna C- jest kationowym polipeptydem o masie cząsteczkowej 13kDa. Ponieważ podlega stałej i równomiernej produkcji i ulega całkowitej filtracji w kłębuszkach nerkowych, cystatna-C jest endogennym markerem filtracji (GFR) lepszym niż beta-2-M i kreatynina.

43 SHBG Steroi Hormons Binding Globulin (globulina wiążąca hormony sterydowe)- oznaczenie SHBG jest polecane w przypadku konieczności wyjaśnienia niskiego lub wysokiego stężenia testosteronu, gdy wolny (biologicznie aktywny) testosteron jest w normie