„Everything should be made

Prezentacja na temat: "„Everything should be made"— Zapis prezentacji:

1 „Everything should be made
Analogi genów odpornościowych Oryza sativa – ich występowanie i struktura. „Everything should be made as simple, as possible but not simpler." - Albert Einstein Grzegorz Koczyk (2004)

2 Od sekwencji do funkcji - bioinformatyka
{A,C,G,T}n Funkcja (np. powielanie informacji genetycznej) {A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V}n/3

3 Homologia Podobieństwo  Pokrewieństwo Homologia Homoplazja

4 Porównywanie sekwencji – czy... ?
NIE można bezpośrednio ocenić homologii. Możemy tylko oceniać ją na podstawie podobieństwa.

5 Porównywanie sekwencji – czy... ?
Statystyczna istotność („nieprzypadkowość”) Biologiczna istotność (homologia) P(S>s) E-value = P(S>s) * n Liczba oczekiwanych false positives przy przeszukiwaniu bazy liczącej n sekwencji

6 Specyficzna odporność „gen-na-gen”
Indukowana odpowiedź obronna przeciwko patogenom (reakcja nadwrażliwości) Specyficzna odporność „gen-na-gen” avr R avr R Odbiór – geny R muszą umożliwiać specyficzne wykrycie konkretnego sygnału - obecności patogenu. Produkt translacji mRNA genu R odbiera sygnał – obecność produktu genu avr (czynnik awirulencji). Przekaz - geny R muszą umożliwiać wywołanie konkretnej reakcji komórki – przekaz sygnały n.p. przez aktywację kaskady kinaz.

7 Geny odpornościowe - struktura:
Cf9 Xa21 LRR LRR SA-CC Błona komórkowa SA kinaza CC TIR-NBS-LRR CC-NBS-LRR LRR LRR Pto kinaza NBS NBS TIR CC

8 Geny odpornościowe – podstawowe domeny:
Nucleotide Binding Site LRR Leucine Rich Repeats NBS Coiled coil / leucine zipper kinase Ser/Thr kinase CC TIR Toll / Interleukin Receptor

9 Ewolucja genów odpornościowych:
Ewolucja – geny R muszą być zdolne do efektywnej odpowiedzi na zmieniające się czynniki w postaci produktów genów avr. Ich ewolucja powinna więc być szybka, a efektywne warianty upowszechniać się w genomie. ALE: Studia porównawcze pokazują że ortologi genów R są bardziej zbliżone do siebie nawzajem niż paralogi. Pewne geny R (Pto, RPS2) to zakonserwowane sekwencje starożytnego (w skali wieku genomu) pchodzenia.

10 Ewolucja genów R - równowaga:
Zamiast skupiania się na efektywności pojedyńczych genów Polimorfizm na poziomie populacji Gwałtowne zmiany specyficzności genów R nadal mogą zachodzi na drodze rekombinacji międzyallelicznej. Odmienne warianty genów R obecne w puli to rezerwuar potencjalnej odporności. Indywidualne geny R są nadal zdolne do szybkiej ewolucji i gwałtownych zmian specyficzności.

11 Poszukiwanie genów odpornościowych in silico (uwagi):
Opisy sekwencji w bazach danych są niedokładne. Lepsze kryteria: wysokie podobieństwo do znanych genów R (E-value < 1e-10; unikanie propagowania fałszywych diagnoz) obecność i względne położenie domen charakterystycznych dla genów R (na podstawie przewidywanej sekwencji białkowej) Geny znalezione przez nasze poszukiwania należą do tej samej klasy strukturalnej, niekoniecznie funkcjonalnej co prawdziwe geny odpornościowe. Stąd: RGA (resistance gene analogs)

12 Poszukiwanie genów odpornościowych in silico (model)
Baza danych sekwencji ryżu (TIGR) BLASTP na zdefiniowanym zbiorze sekwencji referencyjnych HMM („odciski palców”) domen znajdowanych w genach odpornościowych Odpytywanie powstałej struktury danych o RGA (analogi genów odpornościowych) poszczególnych klas strukturalnych. Poszukiwanie nowych wariantów.

13 Narzędzia – BLASTP - wyszukiwanie sekwencji:
Możliwości: poszukiwanie podobieństwa pomiędzy sekwencjami w dużych bazach. ocena prawdopodobieństwa przypadkowego wystąpienia dopasowania do zapytania tak dobrego jak znalezione (E-value). Pułapki: wyniki przeszukiwań są tak dobre jak zbiór sekwencji referencyjnych (niewykryte niewielkie homologie, problemy z wszędobylskimi sekwencjami np. kinazami). ocena prawdopodobieństwa bazuje na pewnym modelu tworzenia losowych sekwencji. Ten model nie musi być zawsze prawdziwy. Omijamy tę wadę używając restrykcyjnych E-value (minimalizacja false positives).

14 Narzędzia - HMM - „odciski palców” domen:
Możliwości: poszukiwanie domen w sekwencjach białkowych. Takie „odciski palców” są dostępne w bazach danych np. Pfam. ocena prawdopodobieństwa przypadkowego wystąpienia dopasowania do „odcisku” tak dobrego jak znalezione. Pułapki: HMMy są tworzone na bazie zbioru sekwencji zawierających domenę – wyniki przeszukiwań są tak dobre jak początkowy zbiór treningowy (przykład: roślinna domena TIR). ocena prawdopodobieństwa bazuje na pewnym modelu tworzenia losowych sekwencji. Ten model nie musi być prawdziwy. Omijamy tę wadę używając empirycznie wyznaczonych gathering thresholds.

15 Sekwencje referencyjne (przeszukiwanie BLASTP):
Klasa Gen Patogen Żywiciel ACC TIR-NBS-LRR RPP5 Peronospora parasitica Arabidopsis thaliana AAF N Tobacco Mosaic Virus Nicotiana tabacum A54810 L6 Melampsora lini Linum usitatissimum T18546 M AAB CC-NBS-LRR RPS2 Pseudomonas syringae p.v. tomato NP RPM1 p.v. maculicola NP

16 Sekwencje referencyjne (przeszukiwanie BLASTP):
Klasa Gen Patogen Żywiciel ACC CC-NBS-LRR I2 Fusarium oxysporium t.sp. lycopersicon Lycopersicon esculentum AAD Mla1 Erysiphe graminis f.sp. hordei Hordeum vulgare AAG3736.1 NBS-LRR Pi-ta Magnaporthe grisea Oryza sativa AAK Pib BAA76281 Xa1 Xanthomonas oryza p.v. oryzae T00020 Pto Pseudomonas syringae p.v. tomato AAF Rpg1 Puccinia graminis f.sp. tritici AAM

17 Sekwencje referencyjne (przeszukiwanie BLASTP):
Klasa Gen Patogen Żywiciel ACC Cf-9 Cladosporium fulvum  Lycopersicon pimpinellifolium CAA Xa21 FLS2 flagellin receptor Arabidopsis thaliana NP_ Xanthomonas oryzae p.v. oryzae Oryza sativa T04313 SA-CC RPW8.1 Erysiphe cichoraceum AAK RPW8.2 AAK

18 Rezultaty przeszukiwania (BLASTP i HMMer):
Klasa Liczebność TIR 1 CC-NBS-LRR* 109 CC-NBS * 70 NBS-LRR* 265 NBS* 153 Pto 545 Xa21 369 (304)* Cf9 242(91)* SA-CC * Wliczając białka o fragmentarycznych NBS. ** W nawiasie liczba przypadków w których przewidziano domenę TM w prawidłowej orientacji.

19 Lokalizacja RGA na chromosomach:

20 Lokalizacja RGA na chromosomach:

21 Podsumowanie i uwagi: 1. Z przewidywanych przez IRGSP genów - około 2,7% (1744 sekwencje) są analogami genów R. 2. Przewidywane 597 sekwencji kodujących białka z domeną NBS, jest bardzo bliskie 600 sekwencjom uzyskanym w pierwotnym szacunku dla „draft sequence” ryżu (IRGSP, 2001). Rozkład tych sekwencji na chromosomach pokrywa się z częstościa występowania znanych genów R u ryżu. 3. Interesujące jest skupienie dużej liczby RGA zawierających domenę NBS na chromosomie 11 (28% znanych genów odpornościowych ryżu jest na chromosomie 11). „An assessment of the resistance gene analogues of Oryza sativa ssp. japonica – their presence and structure” Koczyk G., Chełkowski J. Cell Mol Biol Lett. 2003; 8(4):963-72

22 Przyszły kierunek: Szczegółowe badanie chromosomu 11 (duża liczba potencjalnych genów R, interesujące warianty strukturalne) – dla dokładniejszej sekwencji ryżu. Analiza genomu pszenicy przy pomocy znalezionych sekwencji ryżu (ze szczególnym uwzględnieniem sekwencji zawierających NBS) – obecny temat. 3. Uwagi: potrzeba wzięcia pod uwagę szybko zmiennych, olbrzymich ilości danych – klastrów EST (znaczna część danych) analiza sekwencji na poziomie DNA (nie białka) niemożliwe wyszukiwanie pełnych domen (średnia długość EST około 500 nt)

23 Nucleotide Binding Site – potwierdzone, znane motywy:
Najlepsze dopasowanie P-loop VVSIVGFGGLGKTTLAQxVYN Kin-2 KRYLIVIDDVW RNBS-B GSRIIVTTRIxxVAK GLPL CGGLPLAIKTIASLL RNBS-D CFLYLSLFPED

24 charakterystycznych, zakonserwowanych w ewolucji motywów
EST fishing: Selekcja 153 sekwencje zawierające NBS, z chromosomów 11 i 12 Oryza sativa ssp. japonica Ekstrakcja charakterystycznych, zakonserwowanych w ewolucji motywów Przeszukiwanie >560,000 ESTs (etykietek ekspresyjnych) pszenicy.

25 Poszukiwany kandydat - przykład:
gi| |gb|BJ |BJ300496 LENGTH = 672 COMBINED P-VALUE = 1.62e-26 E-VALUE = 8.1e-21 DIAGRAM: 241_[+1b]_177_[+2b]_158 [+1b] P-loop 2.4e-20 V..V..S..I..V..G..M..G..G..L..G..K..T..T..L..A..Q..Q..V..Y. T..V..S..I..V..G..F..G..G..M..G..K..T..T..L..A..K..A..V..Y. 226 GAAGCATCCATTGAAGACGGTTTCTATTGTTGGATTTGGTGGGATGGGCAAGACAACTCTTGCCAAAGCAGTGTA obszar potencjalnie zmienny (projektowanie primera) .N.. + .D.. 301 TGACAAGCTCAAAGTGCAATTTGATTGTGGTGCCTTTGTTTCAGTTTCTCAAAATCCCGACATCAAGAAGGTTTT [+2b] Kin-2 6.8e-15 K..R..Y..F..I..V..I..D..D..V..W.. K..R..Y..L..I..V..I..D..D..I..W.. 451 GATCGATGAAATCATTGAATTTCTTAATGACAAGAGGTATCTCATCGTAATTGATGATATATGGAATGAAAAATC konserwatywne, dobrze dopasowane wystąpienia motywu podobieństwo do znanych genów odpornościowych

26 EST fishing: Selekcja 153 sekwencje zawierające NBS, z chromosomów 11 i 12 Oryza sativa ssp. japonica Ekstrakcja charakterystycznych, zakonserwowanych w ewolucji motywów (program MEME) Przeszukiwanie >560’000 ESTs (etykietek ekspresyjnych) pszenicy. Konstrukcja primerów na podstawie rejonów zmiennych pomiędzy konserwatywnymi motywami.

27 „Transgeneza i genomika roślin uprawnych”
Założona pod koniec 2003 roku Sieć Naukowa KBN. Skupia zespoły naukowe z Poznania, Warszawy, Wrocławia, Radzikowa... Poświęcona promocji wyników badań, koordynacji współpracy między ośrodkami członkowskimi, tworzeniu i upowszechnianiu analiz bioinformatycznych.

28 „Transgeneza i genomika roślin uprawnych”
Klastr obliczeniowy Końcówka Serwer sieciowy/ Serwer baz danych porównywanie sekwencji (BLAST, WU-BLAST, CLUSTAL) wyszukiwanie domen (HMMer, WISE-2.2, PRODIV-TMHMM) wyszukiwanie zakonserwowanych motywów (MAST/MEME) rekonstrukcja filogenezy (PHYLIP, NJTREE) analiza sekwencji (EMBOSS) predykcja struktury drugorzędowej białek (PSIPRED) wyszukiwanie powtórzonych sekwencji (RepeatMasker) Aktualny projekt badawczy: analiza zdarzeń insercji/delecji w genomach Arabidopsis thaliana Col-0 i Ler

29 Dziękuję za uwagę