Efekty plejotropowe spowodowane wzrostem zawartości związków fenolowych w roślinach lnu transgenicznego Katarzyna Lorenc- Kukuła Instytut Biochemii i Biologii.

Prezentacja na temat: "Efekty plejotropowe spowodowane wzrostem zawartości związków fenolowych w roślinach lnu transgenicznego Katarzyna Lorenc- Kukuła Instytut Biochemii i Biologii."— Zapis prezentacji:

1 Efekty plejotropowe spowodowane wzrostem zawartości związków fenolowych w roślinach lnu transgenicznego Katarzyna Lorenc- Kukuła Instytut Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytet Wrocławski

2 len jest rośliną o bardzo dużym znaczeniu przemysłowym
seeds of the flax are used for extraction of oil and stems for fiber production. The flax fiber is commonly used in the textile industry Linseed oil has commercial value as a component of : farb i lakierów, kitu, pokostu, sztucznego kauczuku, cerat i linoleum, a także w farmaceutyce, przemyśle mydlarskim i spożywczym nie wolno też zapomnieć o odzywczych wlasciwosciach lnu i jego pozytywnym wplywie na perystaltyke jelit i metabolizm, jest stosowany w chorobach ukladu pokarmowego i oddechowego, obniza poziom cholesterolu, glukozy, chroni przed chorobami skory i ma wlasciowosci. Linseed lignans inhibit cell proliferation and growth, making them potential anticancer agents. Studies in animals confirm the anticancer properties of flaxseed lignans. They showed a protective effect against colon and breast cancer, diabetes, atherosclerosis, and immune and inflammatory reactions Thus, linseed oil plays an important role in health care, pharmaceutics, and the food industry

3 Cel projektu uzyskanie lnu o zwiekszonych wlaściwościach antyoksydacyjnych spowolnienie/ zahamowanie procesu jełczenia tłuszczy ustalenie znaczenia flawonoidów oraz kontrolowana manipulacja ich syntezą w celu podwyższenia odporności roślin na stres środowiskowy, choroby oraz szkodniki Linseed oil from common flax cultivars is enriched in polyunsaturated fatty acids (PUFA) kwas linolenowy i linolowy (do 75%) oraz witaminy E - which cause it to be very susceptible to oxidation. This is why the oil from those cultivars is suitable for industrial use rather than for human consumption nasiona lnu są źródłem oleju o dużej zawartości dużym problemem jest nietrwałość kwasów tłuszczowych w czasie utleniania tłuszczów i olejów powstają niebezpieczne wolne rodniki lipidowe (nadtlenki lipidowe), wyzwalające niszczącą reakcją łańcuchową, a także szkodliwe dla zdrowia ketony i aldehydy stad tez starania aby uzyskac odmiany o obnizonej zawartosci tego kwasu, przykladem moze byc wlasnie odmiana Linola (około 3% of linolenic acid). The reduction in the unstable linolenic acid content resulted in the improvement of the oxidative status of this oil; however, even so it needs further protection against oxidation. Generally, lipids in flaxseeds are protected against peroxidation by the addition of natural antioxidants, that is, polyphenols (lignans). However, during extraction, lignans are not effectively extracted with oil. To avoid oxidation, flax oil is supplemented with vitamin E and stored in dark bottles in low temperature. None of these methods, however, is fully satisfactory, and an appearance of rancidity in flax oil is observed innym rozwiazaniem byloby uzyskanie lnu o zwiekszonych wlasciwosciach antyoksydacyjnych zwiększenie właściwości antyoksydacyjnych roślin a tym samym ochrony nienasyconych kwasów tłuszczowych (nasiona lnu), można osiągnąć przez zwiększenie zawartości flawonoidów znajdujących się w roślinie lub zwiększenie ich stabilności znaną grupa antyoksydantow są flawonoidy i stad tez nasze zainteresowanie szlakiem biosyntezy tych związków powyższe punkty dotyczą raczej korzyści, jakie uzyska konsument, ale podwyższenie wl.antyoksydacyjnych bedzie tez mialo korzystny wpływ na rosliny w ten sposob uzyskamy rosliny o podwyzszonej odporosci na patogeny i jednoczesnie ustalimy jakie jest znaczenie flawonoidow w roslinach

4 Flawonoidy wtórne metabolity roślinne
1 2 3 6 1’ 7 8 6’ A B 2’ 4 5 3’ 4’ 5’ wtórne metabolity roślinne wiążą toksyczne pierwiastki (miedź i ołów) hamują peroksydację lipidów ochrona przed patogenami, promieniowaniem UV właściwości antyalergiczne, antywirusowe i przeciwzapalne cenny element w diecie człowieka The biological, pharmacological, and medicinal properties of the plant polyphenols have been extensively reviewed. It has been reported that they have multiple biological activities. It was found that they have antiallergenic, antiviral, and anti-inflammatory activities. It is supposed that consumed together with essential PUFA they lower the risk of various diseases Their antioxidant activity has a great significance for the food’s quality, because they inhibit enzymatic and nonenzymatic peroxidation

5 Konstrukcja roślin W92 syntazy chalkonu (CHS) izomerazy chalkonu (CHI)
w celu zwiększenia właściwości antyoksydacyjnych lnu skonstruowano rośliny transgeniczne, do genomu których, przy użyciu wektora BinAR wprowadzono cDNA z Petuni hybrida kodujący enzymy: syntazy chalkonu (CHS) izomerazy chalkonu (CHI) dehydrogenazy dihydroflawonu (DFR)

6 CHS CHI DFR chalkon flawanon flawan- 3,4- diole antocyjany
Phe PAL C4H lignany 4- kumarynian cynamonian 4CL 4- kumarylo CoA + malonylo CoA CHS chalkon CHI flawanon F3H 3-OH- flawanon DFR taniny flawan- 3,4- diole AS 3- OH- antocyjanidyny 5GT antocyjany

7 Konstrukcja wektora użytego do przygotowania roślin W92
w orientacji sensowej pod kontrolą promotora 35 S i terminatora OCS

8 Preselekcja lnu transgenicznego
C P 0,5 kb C 1,3 kb 0,8 kb 1,4 kb 23 S C plants exhibiting the expected 475-bp fragment in PCR were taken for further selection. The selection was based on mRNA analysis with the use of respective radiolabeled cDNAs. The transgenic lines W92.40, W92.72, and W92.86 showed all three bands representing respective mRNAs; in other cases, two bands (W92.70, W92.39) or no signal (W92.17, W92.21) at all was detected we have chosen all transgenic lines showing positive results in PCR and northern blot analysis.

9 Właściwości antyoksydacyjne lnu- części zielone
The final step of transgenic plant selection was antioxidant capacity analysis in both leaves and seeds. To evaluate the antioxidant properties of transgenic flax extracts, a chemiluminescence method was used. It is based on the chemiluminescent response of luminol to oxidation. Antioxidants in the model system scavenge the reactive oxygen species, which prevents them from oxidizing the luminol and quenching the chemiluminescent light response In this study, five independent transgenic lines, W92.28,W92.40, W92.70, W92.72, and W92.86, selected by means of PCR and northern blot, were assayed for antioxidant capacity Results were expressed as the IC50 parameter, which is the amount of extract inhibiting luminescence by 50%. The lower the IC50, the higher the antioxidant potential The extracts from all transgenic lines overexpressing essential enzymes of the flavonoid synthesis pathway showed significant decrease in IC50 compared with control plants The highest antioxidant capacity of leaves and seedswas obtained for transgenic lines W92.40, W92.70, W92.72,and W The calculated correlation coefficients for the level of mRNA encoding CHS, CHI, and DFR (measured by northern densitometry) and IC50 are -0.79, -0.93, and -0.55, respectively 5x- 91x 40707286 mRNA / IC50: -0.77

10 Właściwości antyoksydacyjne lnu- nasiona F1
R pomiedzy 2004 i 2005 wynosi 0,53 1,5x- 6x 1,3x- 16,6x

11 Właściwości antyoksydacyjne lnu- nasiona F2
Thus, the principal goal of this study was successfully accomplished, and transgenic plants with significant increases in antioxidant capacity were obtained. It should be pointed out that on the basis of the coefficient value the antioxidant status of transgenic plant almost entirely resulted from expression of introduced cDNAs 1,9x- 6,6x

12 Kwasy fenolowe – części zielone
Kwas protokatecholowy Kwas kawowy + chlorogenowy Kwas ferulowy Kwas p- kumarowy 200 400 600 800 1000 C 28 40 70 72 86 mg/100g 20 60 80 100 120 5 10 15 25 30 35 50 150 250 (13%- 27%) Due to the significant increase in antioxidant capacity of transgenic plants, the increase in phenolic compounds content was expected. Thus, we have measured the antioxidant compound content both in the green part (leaves and stems) of the plant and in seeds

13 Kwasy fenolowe (2003,2004) –nasiona F1
(7 %- 25 %) Kwas kawowy Kwas ferulowy Kwas p- kumarowy 2003 (29 %- 42 %) Similarly, in flaxseeds extract, the phenolic acids level was increased in almost the same range (from 7 to 25%) In one case (W92.86), however, a decrease in phenolic acids level (12.5%) was observed 2004

14 Kwasy fenolowe (2004) –nasiona F2
23 %- 39 %

15 IC 50 SADZONKI IC 50 NASIONA F1 F2 KWASY FENOLOWE 2003 - 0,82 - 0,70 - 2004 - 0,9 - 0,88

16 Analiza (HPLC) SDG w nasionach lnu
2 4 6 8 10 12 C 28 40 70 72 86 mg/g Only slight increases in two transgenic lines (12% in W92.40 and 14% in W92.72) were detected. It should be pointed out, however, that those plants showed the highest antioxidant properties. A high positive correlation (correlation coefficient of 0.7) between SDG level and antioxidant capacity of flaxseeds was calculated Thus, the level of lignans may partially affect the antioxidant capacity of the seeds from two transgenic lines, but certainly does not reflect the entire antioxidant status of all investigated lines Some of these compounds have phytoestrogen properties and may protect humans against hormone-dependent cancers such as breast cancer 40- 12% 72- 14% SDG/ IC 50 w nasionach0,7

17 Podstawowe składniki pokarmowe
C 40 72 Sucha masa 92,98 93,02 93,09 Białko ogólne (Nx 6,26) 24,3 23,8 24,4 Popiół surowy (mineralne) 3,6 3,9 5,7 Włókno surowe 7,7 6,3 6,7 BAW- związki bezazotowe wyciągowe 19,1 21,8 20,4 Frakcje włókna Van Soesta NDF 11,46 15,83 14,51 ADF 9,38 7,24 9,63 ADL (lignina) 3,55 1,37 3,61 C 40 72 100 100,04 100,12 97,98 100,66 110,36 159,94 81,51 87,24 113,97 106,54 138,13 126,61 77,19 102,67 38,59 101,69

18 Składniki mineralne Linia Pb [µg/kg] Cd [µg/kg ] Cr Ni [mg/kg] Cl-
NO2- NO3- SO42- HPO42- C <gr oznacz. 389 86,6 250 <0,10 28,6 224 3967 40 48,4 562 231 127 17,7 93,4 3751 72 112 420 145 307 44,0 110 5849 Linia Ca [mg/kg] Mg Cu Zn Mn Fe K [%] Na P C 1666 3710 9,42 72,3 32,4 62,6 1,10 457 0,553 40 1354 3868 7,40 72,4 41,4 83,2 1,05 420 0,461 72 1230 3776 7,21 76,0 48,0 82,7 1,04 439 0,611 Potas jest ważnym składnikiem w nawożeniu lnu, ponieważ poprawia jakość włókna- mniej się zrywa i jest więcej włókna długiego

19 Składniki mineralne - 10 % + 41 %

20 Zawartość tłuszczu ogólnego
od 2 do 7 %

21 Liczba nadtlenkowa Liczba nadtlenkowa jest to ilość cm3 0,002 mol/dm3 roztworu tiosiarczanu sodowego potrzebna do zmiareczkowania jodu wydzielonego z jodku potasowego pod wpływem nadtlenków zawartych w jednym gramie tłuszczu Pierwszym tworzącym się produktem w czasie utleniania jest wodoronadtlenek (hydronadtlenek), którego ilość wyrażana jest jako liczba nadtlenkowa. Rozpad nadtlenków przyspiesza się w podwyższonej temperaturze. Liczba nadtlenkowa może być mniejsza poprzez ogrzewanie w nieobecności tlenu (rafinowanie oleju), co jednak prowadzi do spadku ilości naturalnych antyoksydantów. Im mniejsza ta liczba tym mniejszy stopień utlenienia r = 0.86

22 Liczba jodowa Wartość ta informuje o stopniu nienasycenia tłuszczy/ kwasu tłuszczowego, porzez wiązanie jodu do wiązań podwójnych

23 Liczba anizydynowa tłuszczu z F1 i F2 nie utlenianego promieniami UV
Nadtlenki u jełczejącym oleju są bardzo nietrwałe i rozpadają się na inne produkty – aldehydy i dieny. Liczba anizydynowa wyraża ilość drugorzędowych produktów oksydacji, porzez pomiar spektroftometryczny. Jest liczbą wyrażająca świeżość oleju.

24 Liczba anizydynowa tłuszczu z F1 i F2 utlenianego promieniami UV
r = 0,94  F1 r= 0,71  F2

25 Analiza (GC- FID) kwasów tłuszczowych w nasionach lnu
PUFA 64,0 66,0 68,0 70,0 72,0 74,0 76,0 78,0 80,0 82,0 C 28 40 70 72 86 mol % MUFA 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 32% 7.5% Because of the significant increase in antioxidant capacity of seeds from transgenic plants, the protection of unsaturated fatty acids might occur. Thus, it was of interest to measure the fatty acids composition from seeds. The flaxseed oil was examined by GC- FID Surprisingly, a significant increase in monounsaturated fatty acids in most transgenic lines was detected. The highest increase (54%) was observed in line W Simultaneously, a decrease in polyunsaturated acids (PUFA) content (from 1 to 12%) in those seeds was noticed Thus, the increase in the antioxidant potential of seeds resulted in significant changes in fatty acids composition It was reported that purified PUFA from flaxseeds could enhance in vivo and in vitro lipid peroxidation in tissue Also reported is the significant role of other components (lignans, fiber, and proteins) in oil protection against lipid peroxidation. Thus, we speculate that increases in phenolic acid, MUFA, and lignan levels concomitant with a decrease in PUFA content resulted in higher antioxidative properties of generated plants The increase in stearic and oleic acids levels in transgenic seeds was noted. It is well-known that oil enriched with oleic or stearic acid is more stable during cooking and solid at room temperature MUFA – 72 wzrost o 54% PUFA- od 1% do 12% MUFA (PUFA)/ IC500,91!!

26 Analiza fenotypowa > 36% (15-62%) > 30% dla F2 > 16% (10-22%)
Linia FW nasion na roślinę (g) torebkę (mg) Liczba nasion na torebkę FW pojedynczego nasiona (mg) Kontrola W92.28 W92.40 W92.70 W92.72 W92.86 4.28 ± 0.22 3.25 ± 0.18 5.03 ± 0.29 6.43 ± 0.11 4.91 ± 0.32 6.94 ± 0.19 42,95 1.17 52,51 ± 1.29 49,23 ± 1.03 47,78 ± 1.11 51,28 ± 1.00 47,33 ± 1.43 8,34 ± 1.0 8,66 ± 1.1 8,71 ± 0.6 8,59 ± 1.2 8,95 ± 0.4 8,88 ± 0.7 5,15 ± 0.44 6,06 ± 0.23 5,65 ± 0.31 5,56 ± 0.20 5,73 ± 0.37 5,33 ± 0.25 > 36% (15-62%) > 30% dla F2 > 16% (10-22%) 5% (3-7%) 10% (3-18%) 7% (4- 9%) It is suggested that the increase in antioxidant capacity may result in increasing plant growth, resistance to UV-B radiation, and protection against infectious agents The obtained transgenic plants were visually indistinguishable from the nontransformed control plants Additionally, the yield of seeds [fresh weight (FW) of seeds per plant] and fresh weight of seeds per bag were higher than for the control plants

27 Fenotyp roślin W92 kontrola W92/40 W92/86 26.05.2003 26.05.2003
Transgenic plants, however, showed 3 weeks earlier flowering compared to the control plants

28 Kwitnienie kontrola W92/ W92/40

29 F. culmorum i F. oxysporum
20 40 60 80 100 120 C 28 70 72 86 % F.oxysporum The major fungal pathogen infecting flax plants is Fusarium,which caused the greatest yield decline. It was expected thatthe increase in antioxidant properties of transgenic plants might cause their resistance to pathogen infection. This was the case, resistance to F. culmorum and F. oxysporum in the case of transgenic plants was higher compared to the control plants The high positive correlation (correlation coefficient of 0.9) was established between resistance to Fusarium and phenolic acids content. There is also a high positive correlation (correlation coefficient of 0.7) between resistance to F. culmorum and SDG contents in transgenic lines where increased quantities of this compound were detected. Surprisingly, the high positive correlation (correlation coefficient of 0.9) was also established between resistance to Fusarium and MUFA content. This finding pointed out that MUFA greatly contribute to plant immune response to pathogen infection. Kwasy fenolowe/ IC50 a odporność (0,9) Fusarium.c /SDG 0,7 Fusarium/MUFA 0,9 ?