Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników

Prezentacja na temat: "Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników"— Zapis prezentacji:

1 Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników
E N D O G E N N E E G Z O G E N N E chemioterapia proc. zapalne oksydaza NADPH promien. jonizujące UV peroksysomy toksyny mitochondria H2O2 OH● ONOO– O2●– NO● Reaktywne formy tlenu Inhibicja proliferacji Osłabiona odpowiedź immunologiczna Homeostaza Generacja uszkodzeń Aktywacja szlaków sygnałowych

2 Reaktywne Formy Tlenu ROLA FIZJOLOGICZNA USZKODZENIA I CHOROBY
aktywacja ERK1/2 aktywacja AP-1 translokacja NFκB aktywacja PKC-α peroksydacja lipidów utlenianie cukrów i tioli oksydacja DNA uszkodzenia kwasów nukleinowych odpowiedź zapalna relaksacja mięśni gładkich mitogeneza apoptoza starzenie karcenogeneza miażdżyca choroby neurodegeneracyjne

3 Obrona antyoksydacyjna
NIEENZYMATYCZNA flawonoidy albumina metalotioneiny witaminy ACE melatoniny glutation ENZYMATYCZNA katalaza (CAT) dysmutazy ponadtlenkowe (SOD) peroksydaza glutationu (GPX)

4 dysmutaza ponadtlenkowa lokalizacja komórkowa
0.1% - 2% pobieranego tlenu ulega konwersji do anionorodnika ponadtlenkowego (O2●–) SOD CAT O2●– H2O2 H2O + O2 GPX dysmutaza ponadtlenkowa lokalizacja komórkowa CuZnSOD (SOD1) Cytoplazma MnSOD (SOD2) Mitochondria, błona wewn. ECSOD (SOD3) błona komórkowa, zewn.

5 Manganozależna Dysmutaza Ponadtlenkowa
(MnSOD, SOD2) homotetramer – 88 kDa zawiera jony Mn w miejscu aktywnym zlokalizowana w błonie wewnętrznej mitochondrium kodowana przez gen jądrowy gen MnSOD jest złożony z 5 eksonów i 4 intronów E1 E E E4 E5

6 wszystkie zwierzęta pozbawione genu MnSOD umierają przed 2 tyg. życia
MnSOD jest niezbędny zwierzęta KNOCK-OUT Li et al., 1995: spowolniony wzrost niewydolność fizyczna kardiomiopatia rozstrzeniowa powiększona wątroba depozyty bałkowe w mięśniach szkieletu Lebovitz et al., 1996: zaburzenia motoryczne zmiany degeneracyjne w o.u.n. uszkodzone i napęczniałe mitochondria wszystkie zwierzęta pozbawione genu MnSOD umierają przed 2 tyg. życia

7 Konstrukt DNA użyty do wygenerowania
nadekspresji MnSOD intron Myc tag MnSOD cDNA IRES EGFP GPX pTRE2hyg/SOD2ex plazmid ekspresyjny

8 Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy
Tet-OFF plazmid regulacyjny P CMV tetR VP16 tTA –Dox (Tet) +Dox (Tet) tTA tTA MnSOD EGFP MnSOD EGFP TRE P CMV TRE P CMV plazmid ekspresyjny X X

9 Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy
Tet-ON plazmid regulacyjny P CMV tetR VP16 tTA +Dox (Tet) –Dox (Tet) tTA tTA MnSOD EGFP MnSOD EGFP TRE P CMV TRE P CMV plazmid ekspresyjny X X

10 Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy
Tet-OFF + plazmid ekspresyjny Tet-ON + plazmid ekspresyjny ─ Dox ─ Dox + Dox + Dox

11 Regulowana nadekspresja MnSOD – system
Tet-OFF expression ON expression OFF nadekspresja ekspresja fizjologiczna

12 Regulowana nadekspresja MnSOD – potwierdzenie działania funkcjonalnego
Western blotting z użyciem przeciwciała Anti-MnSOD 1 – komórki nietransfekowane 2 – transfekowane - Dox 3 – transfekowane + Dox Żel aktywności MnSOD 1 – nadekspresja 2 – kontrolna transfekc. 3 – bez transfekc.

13 ĆWICZENIE pSuper-SOD2-RNAi

14 Transfekcje komórek DNA użyty do transfekcji: Tet-OFF + SODex + pSuper Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi

15 ANALIZA FACS Tet-OFF + SODex + pSuper 1
Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi 2

16 ANALIZA FACS Tet-OFF + SODex + pSuper 3
Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi 4

17 Wprowadzić dyskusję nt
Wprowadzić dyskusję nt. jak wykonać eksperyment naukowy do sprawdzenia wyciszania, aktywności Tg na poziomach mRNA i białkowym. Jak zaplanować eksperyment – jakie są potrzebne kontrole ?