Listeria monocytogenes

Prezentacja na temat: "Listeria monocytogenes"— Zapis prezentacji:

1 Listeria monocytogenes
Listeria spp. Listeria monocytogenes

2 Klasyfikacja Domena Bacteria Typ Firmicutes Klasa Bacilli
Rząd Bacillales Rodzina Listeriaceae Rodzaj Listeria Brochothrix

3 Klasyfikacja Rodzaj Listeria Listeria monocytogenes Listeria ivanovii
Listeria innocua Listeria welshimeri Listeria seeligeri Listeria grayi Listeria marthii Listeria fleischmannii Listeria floridensis Listeria aquatica Listeria newyorkensis Listeria cornellensis Listeria rocourtiae Listeria weihenstephanensis Listeria grandensis Listeria riparia Listeria booriae

4 Charakterystyka L. monocytogenes
0.5 – 2 μm długości, μm szerokości regularne, nieprzetrwalnikujące, gramdodatnie pałeczki wykazujące tendencję do polimorfizmu względnie tlenowa nie wytwarza otoczek Bakterie należące do tego rodzaju wykazują tendencję do polimorfizmu, czasami tworzą więc krótkie łańcuszki, dłuższe pałeczki czy nici lub owalne ziarniaki, co może prowadzić do pomyłek w identyfikacji – do mylenia ich z enterokokami (Enterococcus faecalis). W preparatach z hodowli godzinnych układają się często w postaci skupisk palisadowatych z formami V,Y, II. Barwią się gramdodatnio, ale w starych hodowlach (48-72 godz.) występują komórki gramujemne. Tworzeniu nielicznych rzęsek sprzyja temperatura hodowli C i w tej temperaturze charakteryzują się ruchliwością. Natomiast w temperaturze 37C nie wykazują zdolności ruchu, co spowodowane jest ograniczeniem produkcji flagelliny, z której zbudowana jest rzęska.

5 Charakterystyka L. monocytogenes
katalazo-dodatnia, oksydazo-ujemna posiada od 2 do 6 perytrychalnie ułożonych rzęsek zdolność ruchu w wąskim zakresie temp C; w temp. 37 C – nieruchliwa na agarze z krwią wytwarza wąską strefę β – hemolizy

6 Warunki wzrostu

7 Występowanie L. monocytogenes
gleba przewody pokarmowe wielu gatunków zwierząt domowych dzikich wody powierzchniowe ścieki gnijące szczątki roślin kiszonki

8 surowce pochodzenia zwierzęcego i roślinnego
produkty spożywcze środowisko zakładów przetwórstwa przedmioty codziennego użytku (ścierki do naczyń, zlewozmywaki, chłodziarki itp)

9 Listerioza U zwierząt około 90% zachorowań na listeriozę jest spowodowane przez L. monocytogenes, a 10% przez L. ivanovii. U człowieka prawie wszystkie przypadki listeriozy wywołuje L. monocytogenes, rzadko L. ivanovii i L. seeligeri.

10 Wrota zakażenia u ludzi
przewód pokarmowy uszkodzona skóra błony śluzowe układu oddechowego spojówki łożysko

11 Grupa ryzyka Kobiety w ciąży Noworodki
Osoby o obniżonej odporności układu immunologicznego Osoby zaawansowane wiekowo (> 65 lat)

12 Zakażenia u ludzi wywoływane przez L. monocytogenes
Listerioza u człowieka charakteryzuje się zmianami chorobowymi o różnym umiejscowieniu. Występują cztery postacie kliniczne choroby: postać żołądkowo-jelitowa płodowa 2) posocznica noworodków 3) zakażenie ośrodkowego układu nerwowego charakteryzujące się zapaleniem mózgu, zapaleniem mózgu i opon mózgowych

13 Zakażenia u ludzi wywoływane przez L. monocytogenes
Łagodny nieżyt żołądkowo-jelitowy (ang. listerial gastroenteritis) Objawy zakażenia - dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego: dreszcze, bóle głowy, bóle brzucha, nudności, biegunka, bóle mięśni, wymioty, zmęczenie. U zdrowych dorosłych najczęściej rozwija się forma łagodna infekcji z typowymi dolegliwościami ze strony przewodu pokarmowego, takim jak bóle brzucha, nudności, wymioty, a także podwyższona temperatura, dreszcze, bóle mięśni i ogólne osłabienie. Częstość występowania infekcji o łagodnym przebiegu jest trudna do oszacowania, ponieważ część zatruć wywołanych przez L. monocytogenes może przebiegać bezobjawowo.

14 Ostra infekcja (ang. invasive listeriosis)
kobiety w ciąży - infekcja manifestująca się łagodnymi objawami klinicznymi przypominającymi grypę (podwyższona temperatura, bóle głowy, bóle mięśni) lub zapalenie dróg moczowych noworodki: listerioza wczesna – sepsa ujawniająca się bezpośrednio po urodzeniu lub w pierwszym tygodniu życia (śmiertelność 15-50%) listerioza późna – objawy pojawiają się zwykle pomiędzy 8 a 30 dniem życia i jest to zwykle zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (śmiertelność 10-20%)

15 osoby o obniżonej odporności immunologicznej i osoby
starsze – zakażenie ośrodkowego układu nerwowego (zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych) lub zakażenie ogólne z typowymi objawami posocznicy. Rzadziej występuje porażenie nerwów czaszkowych i ropnie mózgu. Często zmianom w ośrodkowym układzie nerwowym towarzyszą zaburzenia psychiczne, a u około 25% pacjentów ataki padaczkowe. inne możliwe powikłania to: ropnie gałki ocznej, zapalenie wsierdzia, zapalenie i ropnie wątroby, zapalenie otrzewnej, zapalenie żołądka i jelit, infekcje skórne i szkieletowe.

16

17

18 Kryterium mikrobiologiczne
Def. Wg Rozp. 2073/2005 Wymaganie pozwalające na akceptację produktu, partii środków spożywczych lub procesu na podstawie braku, obecności lub liczby mikroorganizmów i/lub ilości ich toksyn lub metabolitów w jednostce masy, objętości, na powierzchni lub partii. „mikroorganizmy” – oznaczają bakterie, wirusy, drożdże, pleśnie, glony, pierwotniaki pasożytnicze oraz ich toksyny i metabolity.

19 Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 5 grudnia 2005 r.

20

21 Rozdział 1. Kryteria bezpieczeństwa żywności
Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych Rozdział 1. Kryteria bezpieczeństwa żywności

22 Symbole oznaczają: n - liczba próbek pobranych do badań
m - wartość równa lub poniżej której wszystkie wyniki uznawane są za zadowalające M - wartość maksymalna liczby drobnoustrojów. Wynik jest niezadowalający, jeśli liczba drobnoustrojów w jednej lub kilku próbkach ma wartość M lub ją przekracza. c - liczba próbek, w których dopuszcza się liczbę drobnoustrojów pomiędzy m i M. Wynik jest zadowalający jeśli liczba drobnoustrojów w pozostałych próbkach ma wartość m lub niższą.

23 Według prawa UE (EG) nr 2073/2005 producent musi badać różne artykuły spożywcze w obszarze produkcji na obecność patogenów, np. L. monocytogens. Metody EN ISO oparte na hodowli są wyraźnie przywołane w tym prawie. Jednakże uzyskanie wyniku ujemnego może wymagać > 4 dni (dla L. monocytogenes). (EG) nr 2073/2005 dopuszcza również zastosowanie metod alternatywnych, jeżeli ich walidacja w stosunku do metod ISO zapewnia równoważne wyniki.

24 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne
znormalizowane metody PN ISO* (International Organization for Standarization) uznane urzędowo identyfikacja drobnoustrojów do poziomu rodzaju i/lub gatunku

25 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne
ICS: Mikrobiologia żywności PN-EN ISO 7218:2008/A1: (oryg.) Mikrobiologia żywności i pasz. Wymagania ogólne i zasady badań mikrobiologicznych. ISO/TS :2003/A1:2011 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Guidelines on preparation and production of culture media. Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media

26 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne
ICS: Mikrobiologia żywności PN-EN ISO : wersja angielska Mikrobiologia żywności i pasz. Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych. Ogólne zasady przygotowania zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych. PN-EN ISO : wersja angielska rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych. Część 2: Specyficzne zasady przygotowania mięsa i przetworów mięsnych. PN-EN ISO : wersja angielska rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych. Część 3: Specyficzne zasady przygotowania ryb i przetworów rybnych. PN-EN ISO : wersja angielska Mikrobiologia żywności i pasz --Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych. Część 4: Specyficzne zasady przygotowania próbek produktów różnorodnych

27 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne
ICS: Mikrobiologia żywności PN-EN ISO 7932:2005 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby przypuszczalnych Bacillus cereus. Metoda liczenia kolonii w temperaturze 30 stopni C. PN-ISO 20128:2012 wersja polska Przetwory mleczne - Oznaczanie liczby przypuszczalnego Lactobacillus acidophilus na pożywce selektywnej –Metoda liczenia kolonii w temperaturze 37 stopni C. PN-EN ISO : wersja angielska Mikrobiologia łańcucha żywnościowego -Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter spp. -Część 1: Metoda wykrywania PN-EN ISO : wersja angielska Mikrobiologia łańcucha żywnościowego - Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter spp. - Część 2: Metoda liczenia kolonii

28 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne
ICS: Kosmetyki. Środki higieny osobistej PN-EN ISO 21148: wersja angielska Kosmetyki – Mikrobiologia. Ogólne wytyczne badań mikrobiologicznych PN-EN ISO 11930:2012 (oryg.) Kosmetyki - Mikrobiologia. Test skuteczności i ocena zakonserwowania produktów kosmetycznych PN-EN ISO 16212: wersja angielska Kosmetyki-Mikrobiologia. Oznaczenie liczby drożdzy i pleśni. PN-EN ISO 18416: wersja angielska Kosmetyki-Mikrobiologia. Wykrywanie Candida albicans PN-EN ISO 11930:2012Kosmetyki -- Mikrobiologia -- Test skuteczności i ocena zakonserwowania produktów kosmetycznych Zakres Niniejszy test jest przeznaczony przede wszystkim dla produktów kosmetycznych rozpuszczalnych w wodzie lub mieszających się z wodą i może wymagać dostosowania na przykład do badania produktów, w których woda jest fazą wewnętrzną. Badanie opisane w niniejszej normie dla każdego testowanego mikroorganizmu polega na umieszczeniu masy produktu w kontakcie z kalibrowanym inokulum i następnie śledzeniu zmian liczby mikroorganizmów w ustalonych odstępach określonego czasu i w ustalonej temperaturze

29 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne
ICS:  - Mikrobiologia wody PN-EN ISO 8199:2010 Jakość wody. Ogólne wytyczne oznaczania liczby bakterii metodą hodowli PN-EN ISO :2002 Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych. Część 1: Zminiaturyzowana metoda do badania wód powierzchniowych i ścieków (najbardziej prawdopodobna liczba bakterii) PN-EN ISO :2004 Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych. Część 2: Metoda filtracji membranowej

30 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne
namnożenie drobnoustrojów na odpowiednich podłożach namnażająco-wybiórczych (metody jakościowe) analiza wielu cech morfologicznych, biochemicznych czy serologicznych bakterii, które wyrosły w postaci kolonii na podłożach agarowych

31 wzrost L.mnocytogenes na podłożu bulion Frasera
Bulion pół-Frasera i Frasera - podłoża do selektywnego namnażania Listeria sp. Oprócz składników odżywczych (peptony, ekstrakty) zawierają eskulinę i chlorek litu. Do podłoża po sterylizacji wprowadzany jest roztwór cytrynianu amonowo-żelazowego i dodatek selektywny w postaci roztworu: akryflawiny i kwasu nalidyksowego (w bulionie pół-Frasera jest go połowę mniej). Antybiotyki i chlorek litu silnie hamują wzrost bakterii gramujemnych i większość gramdodatnich. Dodatkowo chlorek litu jest czynnikiem wybiórczym, ze względu na tolerancję wyższych stężeń tej soli przez Listeria spp. Szczepy Listeria hydrolizują eskulinę do eskuletyny i glukozy. Eskuletyna tworzy czarny kompleks z żelazem (III) pochodzącym z cytrynianu. Hodowla na tym podłożu po namnożeniu pałeczek Listeria spp. przybiera czarnoszarą lub czarną barwę. wzrost L.mnocytogenes na podłożu bulion Frasera

32 podłoże chromogenne ALOA (agar Listeria wg Ottaviani i Agosti)
chromogenny substrat: 5-bromo-3-chloro-3-indoxyl--D-glukopiranozyd – wykrywanie aktywności - -D-glukozydazy = kolonie niebieskozielone (wszystkie gatunki Listeria) substrat L--fosfatydyloinozytol wykrywanie aktywności fosfolipazy C specyficznej dla fosfatydyloinozytolu (PI-PLC) = mętne halo Dodatkowo zawiera: mieszaninę antybiotyków (kwas nalidyksowy, ceftazidim, polimyksynę B, cykloheksimid lub amfoterycynę B), chlorek litu.

33 podłoże agar Oxford podłoże agar Palcam
podłoże wybiórczo-różnicujące zawierające w swoim składzie m in. mieszaninę antybiotyków (polimyksynę B, ceftazidim) akryflawinę, mannitol, czerwień fenolową, glukozę, eskulinę, chlorek litu, cytrynian amonowo-żelazowy(III). podłoże wybiórczo-różnicujące zawierające w swoim składzie m. in. mieszaninę antybiotyków (siarczan kolistyny, cefotetan, fosfomycynę, cykloheksymid), akryflawinę, eskulinę, chlorek litu i cytrynian amonowo-żelazowy(III).

34 Testy potwierdzające dla L. monocytogenes
barwienie Grama (G +, cienkie, krótkie pałeczki) test na hemolizę zdolność do fermentacji cukrów (L-ramnoza i D-ksyloza) katalaza (opcjonalnie) ruchliwość w 25 C (opcjonalnie) CAMP test (opcjonalnie) Testy potwierdzające dla Listeria spp. barwienie Grama – (G +, cienkie, krótkie pałeczki) katalaza - dodatnia test VP (Test Vogesa-Proskauera) (opcjonalnie) ruchliwość 25 C (opcjonalnie)

35 ruchliwość w 25 C (opcjonalnie)
test VP(opcjonalnie)

36 Christie–Atkins–Munch–Peterson test
Test CAMP Christie–Atkins–Munch–Peterson test S - Staphylococcus aureus (ATCC lub 49444; NCTC 7428 lub 1803) R - Rhoodococcus equi (ATCC 6939 lub NCTC 1621) R S L. ivanovii s R L. innocua s R L. monocytogenes

37