Wpływ białka ClpB na przeżywalność bakterii E. coli traktowanych olejkiem tymiankowym Opiekun: mgr Tomasz Wenta Magdalena Jaskółkowska Dominika Raszewska SKN Biochemiczne przy Katedrze Biochemii UG SKN przy Katedrze i Zakładzie Biologii i Botaniki Farmaceutycznej Weronika Wyrwas Opiekun: dr Natalia Filipowicz

OLEJEK TYMIANKOWY Thymus vulgaris L. o Uzyskany metodą destylacji z parą wodną w aparacie Derynga przez SKN przy Katedrze i Zakładzie Biologii i Botaniki Farmaceutycznej o Działanie m.in. antybakteryjne, przeciwgrzybicze, antyoksydacyjne, wykrztuśne, rozgrzewające o Główne substancje czynne: TYMOL, KARWAKROL H. Hajimehdipoor i in Fachini-Queiroz FC i in. 2012

SKŁAD OLEJKU Fachini-Queiroz FC i in. 2012

DZIAŁANIE Fachini-Queiroz FC i in µg 30 µg

DZIAŁANIE

Grespan R. i in Właściwości hepatoproteksyjne !!!

CELE PROJEKTU określenie przeżywalności bakterii E. coli MG1655 w zależności od stężenia olejku sprawdzenie czy efekt bakeriobójczy/-statyczny jest zależny od obecności w komórce białek szoku termicznego ClpB

SZCZEPY E. coli MG1655 E. coli MC4100ΔclpB szczep kontrolny szczep z delacją genu kodującego białko związane m.in. z reaktywacją zaagregowanych białek

METODY BADAŃ Ustalenie stężenia procentowego syntetycznego olejku tymiankowego, w jakim działa on bakteriostatycznie/-bójczo na bakterie E. coli w hodowlach płynnych Ustalenie stężenia procentowego syntetycznego olejku tymiankowego, w jakim działa on bakteriostatycznie/-bójczo na bakterie E. coli na podłożach stałych Dodatkowa kontrola i potwierdzenie wyników- hodowla na pożywkach płynnych oraz podłożu stałym po 10 minutowej hodowli z dodatkiem olejku

Ustalenie stężenia procentowego syntetycznego olejku tymiankowego, w jakim działa on bakteriostatycznie/-bójczo na bakterie E. coli w hodowlach płynnych ,5µl 0,0025% 1 µl 0,005% 2 µl 0,01% 4 µl 0,02% 8 µl 0,04% 20 µl 0,1% 1,5 µl 0,0075% Ilość olejku: Stężenie olejku: Dla szczepów E. coli MG1655 i MC4100ΔclpB OD dla każdej próby mierzone co 15/30 min przy długości fali 595 nm Hodowla odmłodzona 37°C 2 godz. 37°C 2 godz.

Tabela z wynikami dla E. coli MG1655

Wykres dla E. coli MG1655

CZAS [min] WARIANT K0,5µl1µl1,5µl2µl4µl8µl20µl 0 0,5140,553 0, ,58150,5880,5930,440,4040,4010,4320, ,65050,6490,6360,410,3030,3990,3890, ,72450,7210,7030,3990,2620,2770,3380, ,7840,7690,7340,3740,2190,2280,3140, ,84850,8280,8270,3660,1990,2090,3070, ,88750,8710,8510,3540,1870,1960,3030, ,9410,9220,8980,3460,1830,1890,2940, ,97350,9560,9310,3250,1850,1860,2980,435 Tabela z wynikami dla E. coli MC4100ΔclpB

Wykres dla E. coli MC4100ΔclpB

Ustalenie stężenia procentowego syntetycznego olejku tymiankowego, w jakim działa on bakteriostatycznie/-bójczo na bakterie E. coli na podłożach stałych 2. 0,75µl 0,003% 0,5µl 0,002% 1,25µl 0,005% 2µl 0,008% 2,5µl 0,01% - 1µl 0,004% Seryjne rozcieńczenia: Przygotowanie płytek: Ilość olejku: Stężenie olejku : µl 10µl 90µl LB µl 10µl... µl 10µl Dla szczepów E. coli MG1655 i MC4100ΔclpB Hodowla odmłodzona

0,004% 0,005% 0,01% E. coli MG1655 E. coli MC4100ΔclpB Bakterie z delecją genu clpB mają obniżoną przeżywalność w stosunku do szczepu kontrolnego o ok % w testowanych stężeniach olejku (0,002-0,015%)

3. Dodatkowa kontrola i potwierdzenie wyników- hodowla na pożywkach płynnych oraz podłożu stałym - 5µl 0,0005% 10 µl 0,001% 30 µl 0,003% 40 µl 0,004% 50 µl 0,005% 20 µl 0,002% Ilość olejku rozc. 100x: Stężenie olejku: Hodowla odmłodzona 37°C 10 min K A D B C E F Do tej pory tylko dla: E. coli MC4100ΔclpB

3. c.d. K A F µl 10µl µl 10µl... µl 10µl 90µl LB Seryjne rozcieńczenia: Kolby z poszczególnymi st. olejku:

0,002% 0,004% 0,005% kontrola Już 10-minutowa inkubacja z olejkiem powoduje nieodwracalne zmiany w przeżywalności bakterii z delecją genu clpB

Wnioski 1. Olejek tymiankowy ma działanie bakteriobójcze w odpowiednim stężeniu dla szczepów E. coli MG1655 oraz E. coli MC4100ΔclpB. 2. Wyniki z hodowli bakterii na podłożu stałym z olejkiem tymiankowym wskazują istotność białka ClpB w przeżywalności bakterii, co wynikać może z funkcji jakie pełni to białko w komórce, poprzez funkcję opiekuńczą gdzie białko ClpB chroni kluczowe białka metabolizmu komórki przed negatywnym działaniem olejku tymiankowego lub jako dezagregaza przywracając właściwą konformację zagregowanym białkom (współudział z systemem DnaK, DnaJ i GrpE).

Plany na przyszłość Zbadanie czy brak małych białek szoku cieplnego (IbpA i IbpB) ma wpływ na przeżywalność komórek w obecności olejku tymiankowego.

Bibliografia Grespan R, Aguiar RP, Giubilei FN, et al. (2014) Hepatoprotective Effect of Pretreatment with Thymus vulgaris Essential Oil in Experimental Model of Acetaminophen-Induced Injury. Evid Based Complement Alternat Med. 2014: Mith H, Dure R, Delecenserie V, et al. (2014) Antimicrobial activities of commercial essential oils and their components against food-borne pathogens and food spoilage bacteria. Food Science & Nutrition 2: Palaniappan, Kavitha; Holley, Richard A. (2010) Use of natural antimicrobials to increase antibiotic susceptibility of drug resistant bacteria. International Journal of Food Microbiology 140 (2–3): 164–8 Trombetta, D.; Castelli, F.; Sarpietro, M. G.; Venuti, V.; Cristani, M.; Daniele, C.; Saija, A.; Mazzanti, G.; Bisignano, G. (2005) Mechanisms of Antibacterial Action of Three Monoterpenes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 49 (6): 2474–8 Mezzoug, N.; Elhadri, A.; Dallouh, A.; Amkiss, S.; Skali, N.S.; Abrini, J.; Zhiri, A.; Baudoux, D.; Diallo, B.; El Jaziri, M.; Idaomar, M. (2007) Investigation of the mutagenic and antimutagenic effects of Origanum compactum essential oil and some of its constituents. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 629 (2): 100 Zarrini G, Bahari-Delgosha Z, Mollazadeh-Moghaddam K, Shahverdi AR (2010) Post-antibacterial effect of thymol. Pharmaceutical biology 48 (6): 633–636