I Krajowe Spotkania Reumatologiczne, Łódź, 8-10.10.2009 Dlaczego limfocyty CD4+ we krwi obwodowej pacjentów chorych na reumatoidalne zapalenie stawów są celem badań? Dr hab. med. Ewa Bryl, Prof. dr hab. med. Jacek M. Witkowski Katedra i Zakład Fizjopatologii, Gdański Uniwersytet Medyczny I Krajowe Spotkania Reumatologiczne, Łódź, 8-10.10.2009

RZS utrudnia i skraca życie Chorzy na RZS znacznie częściej umierają na choroby układu krążenia, infekcje… Oczekiwany czas życia chorych na zaawansowane, ciężkie RZS jest o 10-15 lat krótszy niż średnia życia populacji. 5-letnia śmiertelność chorych na zaawansowane, ciężkie RZS wynosi do 50%, a stopień inwalidztwa w tej populacji sięga 80%. Prawdopodobieństwo przedwczesnej śmierci osób chorych na RZS z objawami pozastawowymi jest 2 razy większe niż tych, u których stwierdzono wyłącznie objawy stawowe. Mortality Mortality rates in RA vary with disease duration and severity, functional status, and degree of comorbidity and extra-articular involvement.1,2 Life expectancy is estimated to be 10 to 15 years shorter in patients with severe disease than in the general US population.3 The rate of premature death may be 50% or more over the next 5 years in patients with severe functional disability, comparable to rates seen in cardiovascular disease and diabetes.4,5 Premature mortality among patients with extra-articular involvement is more than twice that found in the RA population with articular disease only. In fact, the 5-year survival rate is less than 60% in patients who have extra-articular involvement beyond rheumatoid nodules.2 Deaths among the RA population that are directly attributable to RA have been estimated to be between 5% and 30%; the rest are due to comorbid conditions and the cumulative toxicity of certain therapies.2,6,7 Causes of death occurring with greater frequency in people with RA than in the general US population include pulmonary and renal disease, infection, and gastrointestinal bleeding, the latter usually resulting from prolonged drug therapy.1,3 Lymphoproliferative malignancy also contributes to increased mortality in RA.1 Other risk factors for premature mortality include seropositivity, persistent elevation of erythrocyte sedimentation rate, low hemoglobin levels, and involvement of multiple joints.2,5   References: 1. Myllykangas-Luosujärvi RA, Aho K, Isomäki HA, Mortality in rheumatoid arthritis. Semin Arthritis Rheum 25:193-202, 1995. 2. Markenson JA, Worldwide trends in the socioeconomic impact and long-term prognosis of rheumatoid arthritis. Semin Arthritis Rheum 21(Suppl 1):4-12, 1991. 3. Anderson RJ, Rheumatoid arthritis: Clinical and laboratory features, in Klippel JH (ed), Primer on the Rheumatic Diseases. 11th ed. Atlanta, Ga: Arthritis Foundation, 1997, pp 161-167. 4. Spector TD, Rheumatoid arthritis. Rheum Dis Clin North Am 16:513-537, 1990. 5. Pincus T, Aggressive treatment of early rheumatoid arthritis to prevent joint damage. Bull Rheum Dis 47:2-7, 1998. 6. Fuchs HA, Sergent JS, Rheumatoid arthritis: The clinical picture, in Koopman WJ (ed), Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology. Vol 1. 13th ed. Baltimore, Md: Williams & Wilkins, 1997, pp 1041-1070. 7. Harris ED Jr, Clinical features of rheumatoid arthritis, in Kelley WN, Harris ED Jr, Ruddy S et al, Textbook of Rheumatology. Vol 1. 4th ed. Philadelphia, Pa: WB Saunders Company, 1993, pp 874-911. Koivuniemi R et al. „Causes of death in patients with rheumatoid arthritis autopsied during a 40-year period” . Rheumatol Int 2008, 28: 1245-1252

Limfocyty CD4+ jako centralne komórki odpowiedzi immunologicznej… CYTOTOKSYCZNOŚĆ CD8+ B Y PRZECIWCIAŁA PROLIFERACJA IL-3,4,5,10,13 CD4+ IL-2 IL-2 NK CD4+ ? CD4+ IL-2,18 IFNγ IL-2 CYTOTOKSYCZNOŚĆ PREZENTACJA ANTYGENU IL-1 IFNγ FAGOCYTOZA CYTOKINY IL-12 CD4+

2-3x1011 limfocytów T u młodych osób Losy limfocytów T Szpik kostny Grasica Powstawanie różnorodności TCR; TREC Proliferacja Pula obwodowa: 2-3x1011 limfocytów T u młodych osób Losy limfocytów T u młodych, zdrowych osób Śmierć - Apoptoza Dziennie z puli obwodowej znika ok. 1% limfocytów T, zastępowanych przez 2-3 x 109 nowych komórek T.

Grasica – działa u dorosłych ludzi…. Dawniej: Zanik morfologiczny tkanki limfatycznej w grasicy, uważany za całkowity i związany z dojrzewaniem płciowym. Obecne poglądy: nawet u osób w podeszłym wieku zostaje kilka % tkanki limfatycznej w grasicy, o zachowanej pełnej zdolności do produkcji nowych limfocytów T, o różnych TCR i wysokiej zawartości TRECs. 6 dni 15 lat 63 lata

Zmniejszenie ilości TRECs w limfocytach CD4+ – zdrowi i RZS Zmniejszenie liczby TRECs w populacji CD4+ u pacjentów z R.Z.S. następuje wcześniej niż u zdrowych osób. Na podstawie: Koetz K, Bryl E, Spickschen K, O’Fallon M, Goronzy J and Weyand C „T cell homeostatis in patients with rheumatoid arthritis” PNAS 2000, vol 97:920309208, zmienione.

Wypełnianie puli obwodowej limfocytów CD4+ w RZS przez potomstwo zmniejszonej liczby „emigrantów” z grasicy Migrujące prekursory ze szpiku Zdrowi RZS Dojrzewanie i edukacja limfocytów T w grasicy Liczba nowych limfocytów T wychodzących z grasicy Konsekwencje: Zwiększona proliferacja limfocytów T: zmniejszenie różnorodności receptora TCR, skrócenie telomerów Zmiany fenotypowe: wzrost odsetka limfocytów CD4+CD28- Rycina 7. Mniejsza liczba nowych limfocytów T opuszcza grasicę osób chorych na R.Z.S. i na obwodzie przekształca się w pule komórek o ograniczonym repertuarze TCR Efekt proliferacji (pula obwodowa limfocytów CD4+)

Zmniejszenie repertuaru TCR w puli obwodowych limfocytów CD4+ w RZS Oligoklonalność w starzeniu: CD4+ naiwne – po 70 rż CD8+ pamięci – częsta Ref. Wagner et al. PNAS 1998 Naylor K et al. „The influnce of age on T cell generation and TCR diversity” J. Immunol 2005, 174:7446-7452

Skrócenie telomerów w limfocytach CD4+ w RZS – oznaka licznych podziałów komórkowych Polimeraza DNA nie potrafi całkowicie zreplikować końca 5’ na końcu chromosomu. Każdy podział komórki powoduje skrócenie telomerów o 50-100 bp. Zdrowi RZS Na podstawie: Koetz K, Bryl E, Spickschen K, O’Fallon M, Goronzy J and Weyand C „T cell homeostatis in patients with rheumatoid arthritis” PNAS 2000, vol 97:920309208, zmienione; E. Bryl i JM Witkowski „Układ odpornościowy a reumatoidalne zapalenie stawów”. Forum Medycyny Rodzinnej 2008, 2 (3): 196-207

Skrócenie telomerów dotyczy głównie naiwnych limfocytów CD4+ Koetz K, Bryl E, Spickschen K, O’Fallon M, Goronzy J and Weyand C „T cell homeostatis in patients with rheumatoid arthritis” PNAS 2000, vol 97:920309208

Cykl komórkowy limfocytów i współczesne możliwości badania jego kinetyki Transdukcja sygnału: TCR/CD3, CD28, itd… Cykliny, kinazy (cdk) I wiele innych… G0 G1 S G2 M Długość cyklu Liczba prekursorów Czas G0G1 Efektywność proliferacji CFSE: carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester 11

Limfocyty CD4+CD28+ chorych na RZS wykazują znamienne wydłużenie okresu G0G1 pierwszego podziału oraz skrócony czas podziałów. Podobne zjawisko opisano dla limfocytów CD4+CD28+ w procesie starzenia człowieka 1. J. M. Witkowski and E. Bryl, 2004. Experimental Gerontology 39 (4):577-85. 2. E. Bryl and J.M. Witkowski, 2004. Experimental Gerontology 39 (4):587-95.

Parametry podziałów limfocytów CD4+CD28+ u osób zdrowych i chorych na RZS - zestawienie M S RZS Długość cyklu (h) 16.2 12.3 8.7 Liczba podziałów/120h 6.0 5.6 9.1 Liczba prekursorów3/106 127.8 62.4 34.8 Czas G0G1 (h) 26.8 45.2 53.5

Czas G0G1, ale nie długość cyklu komórkowego limfocytów CD4+CD28+ zależy od poziomu ekspresji CD28 1. J. M. Witkowski and E. Bryl, 2004. Experimental Gerontology 39 (4):577-85. 2. E. Bryl and J.M. Witkowski, 2004. Experimental Gerontology 39 (4):587-95. ZDROWI RZS Stwierdzono obniżenie ekspresji CD28 na limfocytach CD4+ osób chorych na RZS zależne od TNF. 1. Bryl E et al. „Down-regulation of CD28 expression by TNFα”. J Immunol 2001, 167:3231-3238 2. Bryl E et al. „Modulation of CD28 expression with anti-tumor necrosis factor α therapy in rheumatoid arthritis”. Arthritis & Rheumatism 2005, 52 (10): 2996-3003 14

Inny dowód na przyspieszone starzenie się limfocytów CD4+ u chorych na RZS - Klotho

Klotho przędzie nić życia…czyli wkład mitologii do gerontologii… Nazwa genu pochodzi od jednej z Mojr, greckich bóstw losu, zwanych przez Rzymian Parkami. KLOTHO, przedstawiana z wrzecionem, przędła nić ludzkiego żywota. Miała dwie siostry - Lachesis snuła nić, Atropos zaś przecinała ją, gdy życie dobiegało końca

Patologie, w których obserwowano udział Klotho Osteoporoza (osteokalcyna, regulacja gosp. Ca/Pi) Nadciśnienie tętnicze Niepłodność Miażdżyca Zmiany zanikowe w skórze Rozedma Zmniejszenie zdolności poznawczych Typ dziki mutant Krótszy czas życia Związane z polimorfizmami genu Klotho (ludzie, myszy) i/lub KO (myszy)

Białko KLOTHO występuje w limfocytach T krwi obwodowej, jego ilość i aktywność jest zmniejszona w komórkach CD4+ osób w podeszłym wieku i chorych na RZS

Zmiany w limfocytach CD4+ krwi obwodowej u pacjentów z RZS - podsumowanie Zwiększony odsetek komórek CD4+CD28- Obniżenie ekspresji cząsteczek CD28 na limfocytach CD4+ (CD4+CD28+) – mniejsza liczba receptorów Zmieniona odpowiedź proliferacyjna na stymulację in vitro Ograniczony repertuar receptora TCR Obniżona liczba TRECs (ang. T cell receptor excision circles) Skrócone telomery Inaktywacja genu Klotho Są analogiczne do obserwowanych w trakcie fizjologicznego starzenia się układu odpornościowego, ale występują u osób w znacznie młodszym wieku metrykalnym, co uzasadnia uznanie reumatoidalnego zapalenia stawów za stan przyspieszonego starzenia się komórek T.

Dziękuję za uwagę